2009～2010年華南地區副豬嗜血桿菌分離株ERIC-PCR指紋圖譜的鑒定和分析

張凌云,徐成剛,張 斌,張建民,郭莉莉,趙 靜,周素明,廖 明

(1.華南農業大學獸醫學院農業部動物疫病防控重點開放實驗室,廣東廣州510642;2.青海大學農牧學院,青海 西寧 810016)

副豬嗜血桿菌(HPS)是巴斯德桿菌科(Pasteurellaceae)嗜血桿菌屬(Haemophilus)的一種豬的專性病原菌,可引起豬多發性漿膜炎、肺炎、關節炎和腦膜炎等疾病,又稱豬格拉氏病[1]。隨著世界養豬業的發展,該病已成為全球范圍內影響養豬業的一種重要細菌性疾病。據Kielstein P(1992)報道,副豬嗜血桿菌存在15個血清型[1],除此之外,還存在很多血清型不定的菌株。由此可見,副豬嗜血桿菌菌株間的差異非常大,僅利用血清分型的手段不僅操作費時費力,而且不能滿足目前廣為流行的副豬嗜血桿菌病的流行病學研究的要求。現代分子生物學技術特別是PCR技術的產生,為細菌流行病學的研究帶來了新的思路,它可對臨床和環境分離菌株進行鑒定、遺傳多樣性分析及克隆傳播的監測。目前,用于副豬嗜血桿菌的分型研究和流行病學調查的方法,有限制性內切酶指紋圖譜[2]、限制性片段長度、多態性聚合酶鏈式反應[3]和腸桿菌基因間重復一致序列聚合酶鏈式反應(enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR,ERIC-PCR)等[4-6]。

腸桿菌基因間重復一致序列聚合酶鏈式反應是根據不同的細菌基因組上的保守重復序列的數目和分布不同,而擴增出由一系列大小不同片段組成的DNA指紋圖譜。該方法以細菌整個染色體為研究對象,能夠在基因組水平上準確反映菌體之間的差異,具有便于操作、特異性強、實用等優點,因此也被應用于副豬嗜血桿菌的分子分型及流行病學的研究[4-6]。

本文采用ERIC-PCR方法以15株不同血清型的副豬嗜血桿菌標準菌株為參照,對2009～2010年間分離自華南地區的41株副豬嗜血桿菌分離株進行分子分型,以期了解近兩年華南地區副豬嗜血桿菌流行菌株的遺傳演化特性及流行特點,為華南地區副豬嗜血桿菌病的研究積累重要的流行病學資料,為更好地防控該病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 41株副豬嗜血桿菌分離株分離自2009年和2010年華南地區33個疑似副豬嗜血桿菌病的豬群,由本實驗室分離、鑒定和保存,15株參考株由華中農業大學陳煥春院士惠贈。本試驗所有的副豬嗜血桿菌均利用加有20μg/m L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(Sigma公司)和5%滅活新生牛血清的胰酪蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)(Oxoid)進行培養,含有5%CO2,37°C 培養 16～24 h。

1.2 方法

1.2.1 血清型鑒定 分離菌株的血清型根據Kielstein-Rapp-Gabrielson(KPG)方法[1]進行鑒定,即用參考菌株制備15個血清型的抗血清,并用瓊脂擴散沉淀試驗對41株分離株的血清型進行鑒定。

1.2.2 DNA制備 取副豬嗜血桿菌分別接種在加有20μg/m L NAD和5%滅活新生牛血清的TSA培養基上復蘇,37℃含5%CO2的環境中過夜培養,收獲菌體,用DNA少量提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.3 ERIC-PCR PCR 引 物 :ERIC-1R(5′-ATGTAAGCTCCTGGGGA TTCAC-3′),ERIC-2(5′-AAGTAAG TGACTGGGGTGAGCG-3′)參照文獻設計[9],由上海英駿生物技術有限公司合成。

PCR反應體系:1μL Taq DNA聚合酶(Invitrogen),2.5μL 10×PCR Buffer,1μL dN TP,1 μL ERIC-1R,1 μL ERIC-2,200 ngDNA 模板 ,加無菌去離子水到25μL體系。同時以去離子水作模板設陰性對照。

PCR反應條件:95℃預變性3 min,94℃變性30 s,55℃復性 40 s,72℃延伸1.5 min,30個循環,最后72℃延伸10 min。

1.2.4 DNA指紋圖譜的分析 ERIC指紋圖譜用BioNumerics 5.1數據庫軟件處理,進行條帶數目、亮度和聚類分析(UPGMA)后產生樹狀圖。并用鑒別指數DI對結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 ERIC-PCR結果 15株副豬嗜血桿菌參考株ERIC-PCR結果見圖1。從圖中可以看出對15株副豬嗜血桿菌參考菌株進行ERIC-PCR擴增后,圖譜條帶清晰,經肉眼觀察14型和15型似乎具有相同的指紋圖譜,經 BioNumerics軟件分析血清型1～15的參考菌株都具有各自特異的指紋圖譜,且指紋圖譜具有可重復性。

圖1 副豬嗜血桿菌參考菌株指紋圖譜

2.2 ERIC-PCR電泳圖譜分類鑒定及聚類分析用BioNumerics5.1軟件用對電泳圖譜進行分類鑒定和聚類分析(UPGMA)后產生系統進化樹狀圖(見表1、圖2)。從結果可看出,56株菌的指紋圖譜多態性較高,共產生41個ERIC基因型,占優勢的ERIC基因型為 E28(4/56)、E19(4/56)和 E31(4/56)。其中15株參考菌株具有各自獨特的指紋圖譜,41株分離株產生了26種不同的指紋圖。從圖2可看出,56株副豬嗜血桿菌可聚集成A、B、C三個群,其中B群為優勢群。血清型和ERIC基因型間沒有必然的聯系,但血清5型和血清12型的菌株有聚集的現象,集中在B群。

表156 株副豬嗜血桿菌血清型和ERIC分型

3 討論

目前,我國副豬嗜血桿菌病的發病率以及該病帶來的經濟損失都呈上升趨勢[7]。由于受到環境、藥物及動物本身狀態等因素的影響,副豬嗜血桿菌的遺傳物質也發生了相應變化,產生了新的基因特征,使得副豬嗜血桿菌的指紋圖譜呈現較高的多態性。為此,本文對華南地區2009～2010年分離的41株副豬嗜血桿菌和15株參考株的基因型進行了ERIC-PCR指紋圖譜鑒定、比較和分析,擬確定華南地區近兩年流行的ERIC基因型,以期了解華南地區副豬嗜血桿菌的流行情況和變化趨勢。

從筆者對副豬嗜血桿菌ERIC指紋圖譜的分析發現,41株分離株都具有特異的 ERIC指紋圖譜,且應用血清學分型方法未能分型的 4株菌株(SC006、SC019、SC053、SC108),通過 ERIC-PCR方法均能分型,從而彌補了傳統血清分型[1]方法的缺陷。

筆者認為ERIC-PCR分型方法、血清分型和流行病學資料相結合有利于對副豬嗜血桿菌進行流行病學研究。如19株來自廣東三水地區的菌株可分為8個ERIC基因型和5個血清型,還有3株未被定為任一血清型。普遍流行的ERIC基因型有E28(4/19),E31(4/19),E19(3/19),且可看出該基因型的菌株有血清2、5、12、15型,這些血清型的菌株都被預測為具有強毒力或中等毒力,因此,推測E28、E31和E19基因型的菌株為廣東三水地區發生格拉氏病的常見菌型。據此可有針對性地采取防控措施,防止副豬嗜血桿菌病的發生和病原的傳播。本試驗是繼李鵬等[6].對2003～2008年部分地區分離的副豬嗜血桿菌ERIC基因分型的后續研究,以對近兩年華南地區副豬嗜血桿菌流行菌株的情況進行及時監測,使副豬嗜血桿菌流行病學資料具有延續性。

本試驗以生物學信息管理軟件BioNumerics 5.1對生物學數據進行分析,通過辛普森多樣性指數計算其鑒別能力得出,ERIC-PCR能夠將遺傳上不相關的副豬嗜血桿菌菌株鑒別開來,且具有較高的鑒別率,為0.984;高于在巴西[5]分離株分型運用中的0.960的鑒別率。此外,對來自5個豬場的13株副豬嗜血桿菌的基因相關性的試驗表明,ERICPCR方法具有種系間相關性的鑒別能力。例如,來自三水A場的菌株SC021和SC022同為ERIC E8型;來自三水C場的菌株SC107,SC108,SC109同為ERIC E19型;來自三水E場菌株SC001,SC009,SC016和SC020同為ERIC E28型。來自廣東肇慶B場菌株SC058和SC059同為ERIC E10;來自云浮D場SC051和SC053同為ERIC E25型。而大部分來自不同地區的菌株指紋圖譜有差異,這和Rafiee M等[4]的報道相一致。

圖2 副豬嗜血桿菌15種血清型參考菌株和41株分離株ERIC-PCR聚類分析

ERIC-PCR具有簡單、快速、成本低,對操作和試劑以及儀器要求都不高的特點,只需要1臺PCR儀就可完成對菌株的基因型的鑒定[7]。對于預測副豬嗜血桿菌菌株的流行趨勢,探究其感染源和傳播途徑等有重要的指導意義。

[1] Kielstein P,Rapp-Gab rielson V.Desig nation of 15 serovars of Haemoph ilus pa rasuis on th e basis of immunodiffusion u sing heatstab le antigen ex tracts[J].Jou rn al of Clinical microbiology,1992,30(4):862-865.

[2] S mart N L,Miniats O P,McInnes J I,etal.Analy sis of Haemo philus parasuis isolates from southern Ontario sw ine by Restriction endonuclease fingerprin ting[J].Can J Vet Res,1988,52:319-324.

[3] del Rio M L,Martin C B,Navas J,et a l.aroA gene PCRRFLP diversity pattern s in Haemo philus parasuis and Actin ob acillus species[J].Research in Veterinary Science,2006,80:55-61.

[4] Rafiee M,Bara M,S tephens C P,eta l.Application of ERICPCR for the comparison of isolates of Haemop hilus parasu is[J].Australian Veterinary Jou rn al,2000,78:846-849.

[5] Macedo N R,Oliveira S R,Lage A P,etal.ERIC-PC R genotyping of Haemop hilus para suis isolates from Brazilian pigs[J].T he Veterinary Jou rnal,2011,188(3):362-364.

[6] 李鵬,李軍星,李玉峰,等.中國東南部地區副豬嗜血桿菌分離株ERIC-PCR指紋圖譜分析[J].中國獸醫學報,2009,29(12):1566-1570.

[7] Nedbalcova K,Satran P,Jang lic Z,eta l.Haemop hilu sp arasu is and Gl?sser′s disease in pigs:a review[J].Veterinarni Medicina,2006,51(5):168-179.