HPLC法測定窈窕茶中大黃酚的含量

周 欣 鐘兆健 宋粉云

（廣東藥學院，廣東 廣州 510006）

窈窕茶為香港注冊的中藥成方制劑，由厚樸、陳皮、決明子等十味中藥制成，具有通便散熱結、利水消腫、理氣健脾的功效。臨床主要用于治療因腸胃積熱、水濕內停導致肢體沉重浮腫，大便秘結、腹脹、腹痛，口干口燥，小便不利等癥狀。決明子為窈窕茶的藥味之一，其主要有效成分為大黃酚，為此建立了窈窕茶中大黃酚含量測定的反相高效液相色譜法，具有分離效果好、靈敏、準確等優點，可控制其質量。

1 儀器與試藥

SHIMADU LC-10Avp（日本島津公司高效液相色譜儀）；SHIMADU SPD-10Avp（日本島津公司紫外檢測器）；SHIMADU SIL-20A（日本島津公司自動進樣器）；SHIMADU LC-10ASvp（日本島津公司柱溫箱）；LC solution工作站（日本島津公司）。超聲波清洗器KQ5200，頻率（35±5）%KHz；功率250W（昆山市超聲儀器有限公司）。

窈窕茶（批號：I0509Y、H1201Y、I06620Y，香港北京制藥廠提供），規格為2g/包；大黃酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，0796-200205）；甲醇為色譜醇，水為雙蒸水，其他化學試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

對照品溶液：精密稱取大黃酚對照品22.0mg，置100mL量瓶中，加無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）稀釋至刻度，搖勻。精密量取20mL，置100mL量瓶中，加無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（大黃酚濃度為44.0μg/mL）。

供試品溶液：取本品裝量差異項下的內容物，混勻，取約10g，精密稱定，置于150mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100mL，密塞，稱定重量；超聲40min；放冷后再稱定，用甲醇補足減失重量，搖勻后濾過。精密量取續濾液50mL，蒸干，加10%鹽酸溶液30mL，水浴中加熱水解1h。冷卻后用三氯甲烷振搖提取4次，每次30mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑。殘渣用無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）溶解，移至10mL量瓶中，用無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

陰性對照溶液：取處方組成中除決明子外的其余成分制成陰性對照，按供試品溶液制備方法處理得陰性對照溶液。

2.2 色譜條件及系統適應性試驗

色譜柱：DiamonsidTM-C18色譜柱柱（250mm×4.6mm，5μm，迪馬公司），流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液（90∶10）；流速：1.0mL/min；檢測波長：254nm；柱溫：40℃。分別吸取大黃酚對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10μL注入色譜儀；理論塔板數以大黃酚峰計算應不低于3000，大黃酚拖尾因子1.10，保留時間約為13min，且大黃酚與相鄰組分峰達到基線分離，陰性樣品對大黃酚測定無干擾；結果見圖1。

圖1 大黃酚對照品、樣品及陰性的高效液相色譜圖

2.3 標準曲線制備

精密量取上述大黃酚對照品溶液分別用無水乙醇-乙酸乙酯（體積比2∶1）制成大黃酚濃度為17.6、22.0、26.4、30.8、35.2、39.6、44.0μg/mL的溶液。依次進樣10μL，每個濃度測定3次以上；以峰面積（A）對對照品溶液系列濃度（C）進行回歸分析，得大黃酚回歸方程：A=47005C-6667.6，相關系數r=0.9996；結果表明大黃酚在17.6～44.0μg/mL范圍內線性關系良好。

2.4 精密度試驗

精密吸取濃度為30.8μg/mL的大黃酚對照品溶液10μL重復進樣5次，測定峰面積的RSD為0.41%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取供試品溶液（批號I0509Y）在0、2、4、6、8、12h分別進樣10μL，記錄峰面積，結果大黃酚峰面積的RSD=1.63%，表明供試品溶液在12h內穩定。

2.6 重復性試驗

精密稱取同一批號（批號I0509Y）樣品6份，按“2.1”項下供試品溶液制備方法制備。依法測定大黃酚的平均含量為0.062mg/g，RSD值為0.91%（n=6），表明分析方法精密度良好。

2.7 加樣回收試驗

精密稱取窈窕茶樣品（批號I0509Y）共6份，每份5g，分別加入相應量的大黃酚對照品，按供試品溶液的制備方法處理并依法測定并計算回收率。測得大黃酚平均回收率為97.6%（n=6），RSD=2.10%；結果見表1。

表1 大黃酚回收率試驗結果（n=6）

2.8 樣品的測定

分別稱取窈窕茶樣品3批（批號：I0509Y、I0602Y 、H1201Y），平均裝量依次為：2.29g、2.24g和2.24g，每批3份，按“2.1”項下供試品溶液制備方法制備，記錄峰面積，代入回歸方程計算樣品中大黃酚的含量；結果見表2。

表2 樣品測定結果

3 討 論

3.1 樣品提取中常規采用加熱回流的方式[1]，實驗中通過與超聲提取方法進行比較后發現超聲亦能達到提取的目的，并且簡化了實驗操作也縮短了時間，經過摸索，最終確定為本文方法，超聲40min[2,3]。

3.2 對流動相的選擇也進行了選擇和比較，由于大黃酚為弱酸性物質，容易解離，因此采用甲醇-磷酸溶液為流動相體系抑制其水解，但是按照藥典方法采用0.1%磷酸溶液時發現拖尾因子較大，峰形不對稱；在參考文獻后，最終確定選用本文中0.2%磷酸溶液為流動相[4-6]，拖尾因子均得到很好的改善，＜1.2，峰形對稱性良好；同時在比較流動相配比后，確定甲醇-0.2%磷酸溶液為90∶10時為最佳，大黃酚出峰時間為約13min，并且與樣品中其他成分達到了很好的分離。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版)一部[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010:135-136.

[2]廖海,周嘉裕,何成生,等.決明子大黃素和大黃酚的提取和含量測定[J].時珍國醫國藥,2007,18(6):1332-1333.

[3]徐雄良,張志榮,孫遜,等.超聲提取法測定熊膽消炎膠囊中大黃素和大黃酚的含量[J].華西藥學雜志,2003,18(6):442-444.

[4]張紅霞,張磊,朱鯤鵬,等.烏玫茶中決明子質量控制方法的研究[J].武警醫學院學報,2008,17(9):765-766.

[5]劉芳,陳建偉.HPLC測定決明子中總大黃酚的含量[J].中成藥,2005,27(5):549-551.

[6]王賓豪,楊榮平,張小梅,等.高效液相色譜法測定決明子中蒽醌類成分的含量[J].時珍國醫國藥,2008,19(1):139-140.