外源性物質(zhì)對(duì)Wnt通路抑制劑DKK的表達(dá)作用

臘 蕾* 班 武 任青青

（1 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510515；2 廣州軍區(qū)總醫(yī)院，廣東 廣州 510010；3 南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515）

Wnt/β-catenin信號(hào)通路（Wnt通路）是調(diào)控細(xì)胞形狀、運(yùn)動(dòng)、黏附、增殖、分化等過程的主要通路之一，該通路的異常活化參與人類多種癌癥的發(fā)病過程，這種異常活化的Wnt通路，有可能產(chǎn)生抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[1,2]。

p53是與許多腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的基因，p53突變或缺失也會(huì)引起腫瘤的發(fā)生，人類腫瘤中常有p53基因突變的發(fā)生，作為腫瘤抑癌基因，p53基因被譽(yù)為“分子警察”，在正常組織細(xì)胞的生長、發(fā)育與分化等過程中起重要作用，其主要生物學(xué)功能是維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定，是一種十分重要的凋亡誘導(dǎo)蛋白。Wnt信號(hào)通路是一條進(jìn)化上保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，其主要功能是促進(jìn)細(xì)胞分裂，阻止細(xì)胞凋亡，在生物學(xué)功能上p53與Wnt通路恰好相反，關(guān)系不密切，但目前的研究表明，Wnt通路與p53之間的關(guān)系非常復(fù)雜，Reed KR等[3]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路的激活可以導(dǎo)致p53蛋白表達(dá)增多，在p53陽性細(xì)胞中有Wnt通路抑制因子Dickkopf-1（DKK-1）的大量表達(dá)，另外，在抑制由Wnt通路誘發(fā)腫瘤的研究中，也發(fā)現(xiàn)p53活性是必須的[4]。可見，弄清楚p53與Wnt通路的關(guān)系對(duì)于闡明二者在腫瘤發(fā)病中所起的作用以及在腫瘤治療中的應(yīng)用價(jià)值是非常有意義的。

近年來我們發(fā)現(xiàn)國際學(xué)術(shù)會(huì)已有對(duì)Wnt通路抑制劑的報(bào)道：WIF（Wnt inhibitory factor）-1，sFRP（secreted Frizzled-related protein），Cerberus，其中抑制劑DKK（Dickkopf）家族中研究最多的為DKK-1[5]，它的作用特征是能夠?qū)︻^部活動(dòng)產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，注射DKK-1mRNA導(dǎo)致一種“放大頭部”的顯型。它通過結(jié)合Wnt受體復(fù)合物的LRP5/LRP6（Low-density-lipoprotein-receptor-related proteins）成分，從而抑制Wnt信號(hào)通路。目前有關(guān)文獻(xiàn)對(duì)抑制劑DKK-家族的成員以及在生物機(jī)體內(nèi)部的調(diào)控是如何表達(dá)的報(bào)導(dǎo)較多，對(duì)于它是否能夠受到外源性因素的影響還不是十分清楚，闡明這些問題對(duì)于抑制劑Dickkopf-1如何在細(xì)胞內(nèi)外的調(diào)控機(jī)制是非常有意義的。因此，本文選擇了外源性物質(zhì)抑癌基因p53和抗腫瘤藥阿霉素對(duì)Wnt通路抑制劑表達(dá)的影響，以了解外源性物質(zhì)是否通過抑制劑介導(dǎo)Wnt通路的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料

Hep3B第二軍醫(yī)大學(xué)郭亞軍博士惠贈(zèng)；Adp53深圳市賽百諾有限公司惠贈(zèng)；小鼠抗人p53抗體為Santa公司產(chǎn)品；羊抗小鼠IgG-FITC為sigma公司產(chǎn)品；Trizol核酸蛋白分離液為Gibico公司產(chǎn)品；AMV酶、dNTP Mixture、Taq酶、Oligo（dT）18為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 HepG2、Lovo、Hep3B、U251細(xì)胞培養(yǎng)

該細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長于DMEM完全培養(yǎng)液中。

1.3 Adp53基因轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞接種于6孔板中，加入感染液（Adp53），每15min搖晃一次，搖勻后放入培養(yǎng)箱中孵育，1h后除去感染液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)

細(xì)胞感染Adp53，經(jīng)阿霉素作用，消化成單細(xì)胞懸液，以多聚甲醛固定，去上清后懸于山羊血清的染色液中半小時(shí)，加入兔抗人β-catenin抗體，小鼠抗人p53后室溫孵育1h，2次洗滌后加入羊抗小鼠-FITC，室溫孵育半小時(shí)后，過400目尼龍網(wǎng)，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 反轉(zhuǎn)錄PCR

收集分別經(jīng)轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染劑量為0.05、0.5、5、50pfu/cell和轉(zhuǎn)染時(shí)間為16、20、24、28、32、36、40h的各個(gè)劑量和時(shí)間點(diǎn)的肝癌細(xì)胞，按使用說明進(jìn)行抽提細(xì)胞總RNA。DKK-1引物序列：上游引物5′-AGGCGTGCAAATCTGTCTCG-3′；下游引物5′-TGCATTTG GATAGCTGGTTTAGT-3′（502bp）；GAPDH引物序列：上游引物5′-CACAGTCCATGCCATCACTGC-3′，下游引物5′-GGTCTACA TGGCAACTGTGAG-3′（609bp）（上海博亞生物技術(shù)有限公司合成）；RT-PCR過程：按產(chǎn)品說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42℃，60min。PCR條件為：94℃ 2min熱啟動(dòng)，94℃ 1min變性，58℃ 1min退火，72℃ 1min延伸，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1 Adp53的轉(zhuǎn)染

將轉(zhuǎn)染劑量為0（空白）、5pfu/cell時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察Adp53的轉(zhuǎn)基因情況，從圖1可看出，對(duì)照組p53表達(dá)呈陰性，未有熒光量顯示，轉(zhuǎn)染Adp53 24h后平均熒光量增加了約50倍，96%以上的細(xì)胞p53表達(dá)呈陽性，表明p53基因轉(zhuǎn)染成功。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)p53蛋白的表達(dá)

2.2 在肝癌細(xì)胞（p53缺失）中Adp53誘導(dǎo)DKK mRNA的時(shí)效關(guān)系表達(dá)

為研究p53對(duì)抑制劑DKK的時(shí)效關(guān)系，我們觀察了轉(zhuǎn)染Adp53，不同時(shí)間后DKK表達(dá)，如圖2所示，抑制劑DKK表達(dá)水平20h后明顯增加，32h最高，36h、40h時(shí)表達(dá)水平逐漸回落，但仍高于對(duì)照組水平。

以上結(jié)果顯示外源性p53對(duì)抑制劑DKK的表達(dá)具有明顯的上調(diào)作用，那么除了p53之外，是否還有其他的外源性物質(zhì)對(duì)抑制劑的表達(dá)具有作用哪？下面我們觀察了抗腫瘤藥阿霉素對(duì)抑制劑DKK表達(dá)的影響。

2.3 阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞DKK mRNA表達(dá)的影響

在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U251，p53突變型）、人大腸癌細(xì)胞（Lovo，含野生型p53）、肝癌細(xì)胞（HepG2，含野生型p53；Hep3B，p53缺失）中加入阿霉素后與對(duì)照組相比DKK-1mRNA表達(dá)水平明顯增加。如圖3所示，結(jié)果表明抗腫瘤藥阿霉素能夠誘導(dǎo)抑制劑的表達(dá)。

圖2 肝癌細(xì)胞中Adp53誘導(dǎo)DKK-1基因表達(dá)的時(shí)效關(guān)系

圖3 化療藥阿霉素在腫瘤細(xì)胞中的DKK-1基因表達(dá)水平

以上結(jié)果顯示外源物質(zhì)Adp53和阿霉素的導(dǎo)入對(duì)抑制劑DKK表達(dá)具有上調(diào)作用，為了進(jìn)一步證實(shí)外源性物質(zhì)對(duì)抑制劑的表達(dá)作用，下面又觀察Wnt通路的關(guān)鍵因子β-catenin表達(dá)水平的變化。

2.4 轉(zhuǎn)染Adp53后肝癌細(xì)胞（p53缺失）關(guān)鍵因子β-catenin時(shí)效關(guān)系的表達(dá)

為研究β-catenin表達(dá)的時(shí)效關(guān)系，我們觀察轉(zhuǎn)染Adp53后在肝癌細(xì)胞Hep3B（p53缺失）β-catenin不同時(shí)間的表達(dá)，如表1所示，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，在轉(zhuǎn)染時(shí)間為24h、36h、48h、60h時(shí)，β-catenin的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)逐漸降低，表達(dá)水平下降，表明在p53誘導(dǎo)抑制劑DKK受到上調(diào)后，Wnt通路受到抑制而引起關(guān)鍵因子β-catenin的下調(diào)（經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P＜0.05）。

表1 肝癌細(xì)胞中Adp53下調(diào)β-catenin表達(dá)的時(shí)效關(guān)系

2.5 加入阿霉素后在人肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中β-catenin的表達(dá)

如圖4、5、6所示，在腫瘤細(xì)胞中，加藥24h后β-catenin的陽性細(xì)胞百分比強(qiáng)度與對(duì)照組相比，表達(dá)水平降低。（經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P＜0.05）。

以上結(jié)果顯示通過外源性p53和抗腫瘤藥阿霉素的導(dǎo)入，關(guān)鍵因子β-catenin的表達(dá)水平下降，在時(shí)間及劑量上β-catenin這種變化與p53和抗腫瘤藥阿霉素對(duì)抑制劑DKK具有上調(diào)作用是相吻合的，表明外源性p53和阿霉素能誘導(dǎo)DKK的表達(dá)，進(jìn)而引起Wnt通路的抑制。

圖4 肝癌細(xì)胞(HepG2，wt p53)中阿霉素對(duì)β-catenin起下調(diào)作用

圖5 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251，mutant p53)中阿霉素對(duì)β-catenin起下調(diào)作用

圖6 肝癌細(xì)胞(Hep3B，p53 null)中阿霉素對(duì)β-catenin起下調(diào)作用

3 討 論

Wnt信號(hào)通路在生物發(fā)育、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、腫瘤形成及細(xì)胞凋亡等生命過程中發(fā)揮重要的作用，其通路異常活化與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展關(guān)系密切。正規(guī)的Wnt信號(hào)只有在卷曲蛋白和輔助受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（low density lipoprotein receptor related protein，LRP）均與Wnt結(jié)合后通過其下游蛋白的磷酸化與去磷酸化過程來完成Wnt信號(hào)途徑的傳遞。在沒有Wnt信號(hào)刺激的情況下，胞質(zhì)內(nèi)的GSK-3β能與其它蛋白以復(fù)合物的形式磷酸化β-catenin，使β-catenin降解，β-catenin處于低水平狀態(tài)。在有Wnt信號(hào)刺激的情況下，由細(xì)胞分泌的Wnt蛋白與細(xì)胞表面受體FZD（frizzled protein receptor）和LRP5/6結(jié)合后，即激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，不能磷酸化β-catenin，導(dǎo)致β-catenin積聚進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)靶基因無限制轉(zhuǎn)錄，腫瘤細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果顯示，加入外源性物質(zhì)p53后，在腫瘤細(xì)胞中，外源性p53對(duì)抑制劑Dkk在時(shí)效關(guān)系上具有明顯的誘導(dǎo)作用（圖2），加入阿霉素后，抑制劑DKKmRNA的表達(dá)水平下降（圖3），Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子β-catenin表達(dá)水平下降（見圖4、5、6），從而抑制Wnt通路，這說明化療藥阿霉素和外源性p53對(duì)DKK具有顯著的誘導(dǎo)作用。化療藥阿霉素的抗腫瘤作用可嵌入DNA的堿基對(duì)之間，使DNA鏈裂解，阻礙DNA及RNA的合成，而且，損傷的DNA能夠引起p53的表達(dá)，因此，p53-DNA-DKK三者之間是否存在著一定的相關(guān)性哪？實(shí)驗(yàn)中，我們挑選了幾種不同p53狀態(tài)的細(xì)胞，結(jié)果表明，抑制劑DKK-1對(duì)p53野生型細(xì)胞、突變型細(xì)胞、完全缺失的細(xì)胞均有明顯的誘導(dǎo)作用，在抗腫瘤藥阿霉素的作用下呈現(xiàn)明顯上調(diào)的效果，說明外源性抗腫瘤藥阿霉素能夠誘導(dǎo)抑制劑DKK的表達(dá)，抗腫瘤藥誘導(dǎo)抑制劑DKK，很可能是它們抗腫瘤作用的其中一種方式，現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)說明，抑癌基因p53和抗腫瘤藥阿霉素還可通過對(duì)抑制劑DKK的上調(diào)作用，從而抑制Wnt通路，抑制劑DKK可能是p53和阿霉素抗腫瘤作用的一個(gè)靶點(diǎn)，這很可能是p53和阿霉素抗腫瘤作用的另外一種方式。因此，通過對(duì)新作用環(huán)節(jié)的研究，進(jìn)一步探尋抗腫瘤的新靶點(diǎn)是非常有意義的。

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