鴨β-防御素-2基因的克隆測序與組織表達分析

張輝華，羅艷娜，，謝青梅，馬靜云，楊承忠，韓小鳳，，畢英佐

（1.佛山科學技術學院生命科學院，廣東 佛山 528231；2.華南農業大學動物科學院 ，廣東 廣州 510642）

防御素是一類古老的內源性抗菌多肽，廣泛存在于動物體內。自Evans等［1］從雞與火雞異嗜性白細胞中發現β-防御素后，已陸續從雞、鴨、鴕鳥、鵝和企鵝等禽類動物體內分離發現約30個禽β-防御素基因［2-6］。根據Lynn等［7］的建議，國際上對禽防御素命名進行了統一規定，所有禽來源的防御素都命名為AvBDs（Avian beta-defensins）。上傳至NCBI GenBank中登記注冊的鴨β-防御素基因序列有AvBD2、AvBD6、AvBD9、AvBD10。對鴨 AvBD2的生物學功能研究表明，體外具有抗菌活性與趨化活性［4，8-9］，具有潛在的應用價值。因此，本試驗對鴨AvBD2基因進行了克隆、序列分析與比較及在機體各組織器官分布的研究，以期為對其功能及調控表達奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 載體與受體菌 質粒pMD-18T購自寶生物工程（大連）有限公司；受體菌JM109為華南農業大學家禽基因工程實驗室保存。

1.2 工具酶與主要試劑 質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒為Omega公司產品；Trizol Reagent Kit、AMV、Premix Ex Taq聚合酶為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.3 引物 根據GenBank上發表的鴨AvBD2（登錄號：AY641439）及β-actin基因序列和PCR引物的設計原則，并借助計算機軟件DNAStar進行輔助分析，設計了4條PCR引物，分別用于進行鴨AvBD2與β-actin基因的擴增。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列如下。

Duck2-P1：5′-GAGGGAAGGGACCAAGAAGA-3′；Duck2-P2：5′-GGTTGTAACAGGAAGGAGATT-3′；β-actin-P1：5′-ATGTACCCGGGCATCGCTG-3′；β-actin-P2：5′-TCAGAAGCATTTGCGGTGG-3′

1.4 肝臟總RNA提取 取脾臟組織約0.1g，按Trizol試劑盒說明方法提取總RNA。

1.5 鴨AvBD2基因的RT-PCR擴增 通過二步法進行RT-PCR。反轉錄反應體系：RNA 1μL，10x RT Buffer 1μL，dNTPs（各10mmol／L）1μL，RNA酶抑制劑0.25μL，Oligo dT-Adapter Primer 0.5 μL，AMV 0.5μL，MgCl22μL，DEPC水補至10 μL。混勻后，30℃反應10min，42℃反應30min，99℃反應5min，5℃冷卻5min。反轉錄產物直接用于PCR擴增。PCR反應體系為：Ex Taq 12.5 μL，引物各0.5μL，模板1μL，雙蒸水補至25μL。PCR程序：94℃預變性3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30個循環；72℃后延伸10min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.6 PCR產物的克隆與序列分析 PCR產物經過凝膠純化回收后，與載體pMD-18T在下列反應體系中4℃過夜連接：Buffer 5μL，pMD-18T1μL，PCR產物4μL。連接產物直接用于轉化JM109感受態細胞。挑取單個的白色菌落，接種于3mL含Amp的LB液體培養基中，37℃振搖培養過夜，然后進行菌落PCR與酶切鑒定。酶切鑒定正確的進行測序。所獲得的DNA序列用BLAST程序進行相似性檢索比較。

1.7 鴨AvBD2的組織分布 取1日齡和20日齡“仙湖肉鴨”各3只，放血致死。采皮膚、舌、食道、氣管、心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟、腔上囊、胸腺、骨髓、胸肌、腺胃、肌胃、小腸和胰臟組織各1g凍存。提取凍存組織RNA，進行RT-PCR，檢測鴨AvBD2在各個組織器官的分布情況。

2 結果與分析

2.1 鴨AvBD2基因的RT-PCR擴增 取鴨肝臟組織，提取總RNA，用鴨AvBD2特異引物，經RT-PCR擴增得到一個基因片段，RT-PCR產物于2%瓊脂糖凝膠電泳，可以見到1條約350bp大小與預期長度相吻合目的電泳條帶（圖1）。PCR產物克隆至載體pMD-18T上，圖2為其酶切及菌落PCR結果。

2.2 鴨AvBD2基因測序結果及分析 測序結果見圖3。克隆片段核苷酸序列長為350bp，包含一個長為195bp的ORF框。利用BLAST程序進行核苷酸序列比對，發現與GenBank中鴨AvBD2的核苷酸序列有98%～100%的相似性，表明所克隆到的片段為鴨AvBD2基因序列。利用信號肽分析軟件對ORF框信號肽序列進行分析（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／），得知信號肽裂解位點在22與23位氨基酸之間，即：-GLS-LP-間（見圖3）。以編碼區序列進行BLAST，發現同GenBank中已注冊的鴨AvBD2基因相似性為98%與100%。相似性為100%的是中國品種鴨，相似性為98%的是國外品種鴨。差異表現為3個堿基的變化，分別是編碼區98位堿基由A→T，136位堿基由A→G及150位堿基由C→T；導致有2個氨基酸的變化，即33位氨基酸由K→I，46位氨基酸由I→V。由于氨基酸的變異，導致分子量產生變化及pI值的變異。預測本研究克隆到的鴨AvBD2分子量大小為7334.93Da，pI值為9.09。Soman等［7］報道的國外品種鴨AvBD2其分子量大小為7305.89Da，pI值為8.81。

圖3 鴨AvBD2基因測序結果與序列分析

2.3 鴨AvBD2基因的組織器官中分布 對1日齡與20日齡鴨17個組織器官該基因進行檢測，結果為AvBD2基因在脾臟和腎臟中大量表達；心臟和肝臟中有少量表達；肺臟和骨髓有中等水平表達；在胸腺、腔上囊、小腸、胰腺、腺胃、食管、氣管、舌頭、胸肌、卵巢、皮膚中未見表達。結果見圖4、圖5。

圖4 AvBD2基因組織器官RT-PCR擴增結果

圖5 AvBD2基因組織器官RT-PCR擴增結果

3 討論

通過RT-PCR技術，本研究克隆獲得長為350 bp的鴨AvBD2基因。目前，在GenBank中公布的鴨AvBD2基因序列有3條，2條是國外品種，1條是國內品種。對成熟肽段核苷酸序列進行比對時發現，2個國外品種鴨的核苷酸序列完全相同，國內品種鴨的序列與本研究克隆到的序列也完全相同，但國內與國外品種鴨間有3個核苷酸的變化，導致2個氨基酸的變異。這種變化是物種在遺傳選擇過程中的自然選擇所致，還是由于其他外部原因導致的，非常值得分析。尤其是這種差異表現在國內品種鴨與國外品種鴨之間，環境或疾病因素是否是導致序列發生變化的主要因素，這種變化對其生物學功能是否產生影響，值得研究。另外，這種變化在鴨其他種類β-防御素基因上是否也有，由于對鴨防御素基因研究還比較晚，上傳序列少，沒辦法作出比較。因此還需要有更多的序列及其他種類防御素基因克隆出來以后，才能做出準確的判斷。不過在對雞AvBD-1基因的研究過程發現，AvBD-1有兩種形式，即AvBD-1與AvBD-1（α）。它們之間的區別僅是基因序列上編碼區3個堿基的不同，導致3個氨基酸的變異，發生變異的AvBD-1稱為AvBD-1（α）［10］。Harwig等［11］也從雞異嗜性白細胞中分離純化出這兩種多肽，因此可以排除是等位基因。這兩個基因高度的同源性表明這兩個基因起源于一個關系非常近的復制子。這種現象在人α-防御素HNP-1與HNP-3之間也存在，這兩個基因編碼區核苷酸也只有2個不同，導致2個氨基酸發生改變，而且在整個基因全長（3.7kb）DNA序列上也只有17個核苷酸的差異，同樣表明，這兩個基因高度的同源性表明這兩個基因起源于一個非常近的復制子［12］。現在情況是否與此相似，也有待于研究。

對鴨AvBD2在機體不同組織部位表達分布的研究結果表明，鴨AvBD2在1日齡與20日齡鴨的脾臟和腎臟組織中均大量表達，在骨髓中呈中等水平表達，在心臟和肝臟中僅少量表達，在其他組織器官中均未檢測到有表達。與Soman等［5］的研究發現有所不同，他們的結果是鴨AvBD2在脾臟和骨髓中大量表達，腔上囊、卵巢、小腸也有少量表達。可能原因是與鴨品種不同相關。防御素基因在不同組織中的表達差異性，是與其功能相關的［13］。如雞 AvBD5、AvBD9和AvBD10在小腸等消化系統組織中有一定量的表達，重組蛋白有抗大腸桿菌、豬致病性鏈球菌、金黃色葡萄球菌和多殺性巴氏桿菌的活性［14-15］。本研究利用RT-PCR技術成功擴增到鴨AvBD2基因，為進一步對該基因的功能研究奠定基礎。

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