檢測豬戊型肝炎病毒的熒光定量PCR方法的建立

張亮權，歐陽昀，劉志剛，曹宗喜，閆明菲，王文華，郭泗虎，張桂紅

（華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州 510642）

戊型肝炎（hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）引起的一種經糞口途徑傳播的人獸共患病。從1955～1956年在印度新德里［1］第一次HE大暴發至今，HE已廣泛分布于亞洲、非洲及中美洲等發展中國家。新疆是我國HE的高發地區，曾在1986～1988年間暴發該病，是世界上一次大規模的流行，共計發病119280例，死亡707例［2］。

1997年Meng等［3］從豬體內分離出1株野生型HEV，發現其與人類的HEV有極高的同源性，并可感染黑猩猩和恒河猴，因此推測豬可能是HEV感染的一個動物宿主。目前研究表明，HEV在豬群中普遍存在，已經被世界衛生組織認定是發展中國家的一個重要公共衛生問題。因此，對豬源戊型肝炎（swHE）診斷方法的研究十分必要。而熒光定量PCR（Real-time PCR）具有快速、靈敏、特異等特點，適用于swHEV的檢測，本試驗就建立了檢測豬群中HEV的熒光定量PCR方法。

1 材料與方法

1.1 病毒與樣品來源 豬源戊型肝炎病毒（swHEV），豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬瘟病毒（CSFV）、圓環病毒2型（PCV2）、豬流感病毒（H1、H3亞型SIV）均由本研究室分離保存；16份膽汁樣品采集于廣東省某獸醫院。

1.2 主要試劑和儀器 AMV反轉錄酶，Ex Taq DNA聚合酶，pMDl8-T載體［寶生物工程（大連）有限公司］；SYBR qPCR MIX（TOYOBO公司）；熒光定量PCR儀（ABI PRISM 7500型）。

1.3 引物的設計和合成 根據GenBank中swHEV ORF2核苷酸序列的保守區域，應用Primer premier 5.0設計了一對引物并由Invitrogen公司合成，預期擴增片段為126bp。上游引物：5′-CAGAATTGATTTCGTCGG-3′；下游引物：5′-TAGCTATACCCTTGTCCTGCTG-3′。

1.4 樣品的處理 膽汁樣品用滅菌PBS配成10%的懸浮液，4℃～8000r／min離心10min，取上清，-40℃保存。

1.5 病毒RNA的提取與cDNA的合成 按Invitrogen公司TRIzol?Reagent RNA提取試劑盒的使用說明進行總RNA的抽提，用AMV逆轉錄酶將總RNA逆轉錄成cDNA，置-20℃保存。

1.6 標準陽性質粒的制備 以cDNA為模板，用上述的1對特異性引物進行PCR擴增后，將回收純化的PCR產物裝入pMD18-T載體，經PCR和測序鑒定正確的陽性重組質粒命名為pMD-swHEV。用分光光度計測量陽性質粒的濃度，定量并稀釋至1.0×109拷貝／μL，-20℃保存。

1.7 熒光定量PCR反應系統 熒光定量PCR反應總體積為20μL，其中SYBR qPCR MI×10μL，上、下游引物各0.8μL，模板1μL，滅菌去離子水補足。反應條件為：95℃預變性1min；95℃變性15s，55℃退火15s，72℃延伸35s并檢測熒光，40個循環。

1.8 標準曲線的建立及穩定性分析 用滅菌去離子水將標準陽性質粒稀釋成1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷貝／μL，作為模板進行熒光定量PCR，每個稀釋度作3次重復。

1.9 特異性試驗 分別以swHEV、PRRSV、FMDV、CSFV、PCV2、H1和 H3亞型SIV的DNA或cDNA為模板進行熒光定量PCR，并設立空白對照。

1.10 熒光定量PCR與逆轉錄巢式PCR（RT-nPCR）的比較分析 分別用熒光定量PCR與RT-nPCR［4］檢測16份膽汁樣品進行比較分析。

2 結果

2.1 標準曲線 建立的標準曲線的相關系數（r2）為0.998，以標準陽性質粒的拷貝數對數為橫坐標，Ct值為縱坐標建立標準曲線（圖1）：y=-3.039x+37.983。

圖1 swHEV熒光定量PCR的標準曲線

2.2 穩定性分析結果 用8個不同稀釋度的標準陽性質粒進行3組平行試驗，Ct值變異系數（CV）在0.17%～1.41%之間（表1），顯示出良好的重復性。

表1 熒光定量PCR的穩定性分析

2.3 特異性試驗結果 從圖2可知，對于swHEV出現了特異性的擴增曲線，CT值為25.09。而對于PRRSV、FMDV、CSFV、PCV2、H1亞型SIV、H3亞型SIV以及陰性對照，均沒有產生熒光信號。

圖2 熒光定量PCR的特異性分析

2.4 熒光定量PCR與RT-nPCR的比較分析結果 分別用熒光定量PCR與RT-nPCR檢測16份膽汁樣品，結果顯示（表2），熒光定量PCR除了檢測出RT-nPCR檢出的7份陽性外，還檢測出2份為陽性，RT-nPCR的最低檢出濃度約為2.05×102拷貝／μL，而熒光定量PCR的最低檢測濃度約為1.52×101拷貝／μL，表明熒光定量PCR的檢測靈敏度比RT-nPCR約高10倍。

3 討論

HE是一種能引起人和多種動物［3，5-6］感染的人獸共患病，人對HEV普遍易感，青壯年病死率可達1%～2%，孕婦病死率高達20%［7］。而豬感染HEV的現象普遍存在，因此，對swHEV診斷方法的研究具有重要的意義。

豬感染HEV后，很少有明顯的臨床癥狀［8］，這對swHEV的臨床診斷帶來很大的不便，需要進行實驗室診斷。RT-nPCR是檢測HEV核酸最常用的方法之一，然而swHEV病毒血癥持續時間和糞便的排毒時間都很短，而且載毒量低，使該檢測方法出現不穩定的現象。與RT-nPCR相比，熒光定量PCR具有更高的特異性和靈敏度，可作為swHEV的有效檢測系統。

表2 熒光定量PCR與RT-nPCR的比較分析

本試驗建立的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法靈敏度高，特異性強，并且具備良好的穩定性，適用于swHEV的檢測，能為HEV的防治提供很好的技術支持。

［1］Wong D C，Purcell R H，Sreenivasan M A，et al.Epidemic and endemic hepatitis in India：evidence for a non-A，non-B hepatitis virus aetiology［J］.Lancet，1980，2（8200）：876-879.

［2］耿彥生，王佑春.戊型肝炎病毒感染免疫研究進展［J］.世界華人消化雜志，2010，18（9）：897-901.

［3］Meng X J，Robert H P，Pat rick G H，et al.A novel virus swine is closely related to the human hepatitis E virus［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：9860-9865.

［4］劉志剛，曹宗喜，張得玉，等.廣東地區豬源戊型肝炎病毒的檢測和核苷酸序列分析［J］.黑龍江畜牧獸醫，2011，9：94-96.

［5］Sun Z F，Larsen C T，Dunlop A，et al.Genetic identification of from healthy chicken flocks and characterization of the capsid from chickens with hepatitis splenomegaly syndrome in different United States［J］.J Gen Virol，2004，8（Pt3）：693-700.

［6］Okamoto H，Takahashi M，Nishizawa T，et al.Presence of antibodies to hepatitis E virus in Japanese pet cats［J］.Infection，2004，32（1）：57-58.

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［8］Meng X J，Halbur P G，Haynes J S，et al.Experimental infection of pigs with the newly identified swine hepatitis E virus（swine HEV），but not with human strains of HEV［J］.Arch Virol，1998，143（7）：14052-14151.