豬傳染性胃腸炎病毒陜西株的分離鑒定

丁 利，陳光達，許信剛，童德文

（西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100）

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬成員，由其引發的豬傳染性胃腸炎是豬的一種急性、高度接觸性傳染病，臨床以嘔吐、嚴重腹瀉、脫水和對2周齡以內仔豬高度致死率為特征。5周齡以上的豬死亡率較低，成年豬幾乎沒有死亡，但感染豬生長緩慢，飼料報酬率降低。世界動物衛生組織（OIE）將TGE定為B類傳染病，是我國法定重點防控的疫病之一。本病在許多國家和地區廣泛流行，經流行病學調查發現，近年來該病在我國的流行呈明顯上升趨勢，同時亦有病毒的分離報道［1-5］。本試驗從陜西省某豬場發病豬只的腹瀉糞便等樣品中分離到1株豬傳染性胃腸炎病毒，命名為TGEV shaanxi株，并對其進行了系統鑒定。

1 材料與方法

1.1 病料和細胞 空腸內容物及腹瀉糞便采集于陜西省某疑似感染TGE的豬場，于滅菌生理鹽水中凍存，低溫運至實驗室備用；PK-15細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 DMEM為Gibco公司產品；胰酶、瓊脂糖、RNase A為Sigma公司產品；新生牛血清為 Hyclone公司產品；Taq DNA聚合酶、DL-～DNA Marker、pMD18-T vector，購自大連TaKaRa公司；M-MLV逆轉錄酶，購自Promega公司；病毒基因組RNA提取試劑盒，購自BioTeke公司；高純度質粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒，購自威格拉斯生物技術有限公司；豬傳染性胃腸炎病毒弱毒疫苗，購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所；受體菌DH5α、豬傳染性胃腸炎病毒陽性血清由中國動物衛生與流行病中心惠贈。

1.3 方法

1.3.1 病料的處理 解凍TGE病豬的空腸內容物以及腹瀉糞樣，反復凍融3次后，6000r／min離心5min，收集上清液，上清液經0.22μm孔徑細菌濾器除菌后，置-20℃凍存備用。

1.3.2 病毒分離培養 將過濾后的病料上清液1mL接種于單層PK-15細胞，37℃吸附1h，棄上清后加入含2%新生牛血清的DMEM培養液，置37℃，5%CO2培養箱中培養3～5d，觀察細胞病變（CPE）。將培養細胞反復凍融3次，取凍融液1mL盲傳3～6代進行病毒分離和細胞適應，傳至出現較穩定的CPE后收毒，盲傳6代未出現CPE則判為陰性。

1.3.3 病毒TCID50的測定 按照參考文獻［6］方法進行。

1.3.4 核酸類型鑒定及氯仿試驗 按照參考文獻［3］方法進行。

1.3.5 病毒中和試驗 將TGEV陽性血清進行系列稀釋（1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280），加到96孔反應板中，25μL／孔；將病毒稀釋到200TCID50，加入到上述各反應孔中，25μL／孔，37℃作用1h；按常規方法制成細胞懸液，50μL／孔加到上述各孔中，37℃培養，逐日觀察并記錄CPE。同時設立正常細胞對照、不加血清的病毒液對照、陰性血清對照。

1.3.6 引物設計與合成 根據GenBank中公布的TGEV基因序列，利用計算機輔助軟件Premier 5.0設計一對特異性引物，上游引物為P1：5′-ATGGCCAACCAGGGACAAC-3′；下游引物為P2：5′-TGGAGGAAGACGAGCATC-3′），用于擴增1149bp的N基因

1.3.7 病毒RNA 提取和RT-PCR 參照病毒基因組RNA 提取試劑盒說明書從細胞毒中提取總RNA。RT體系：RNA模板2μL、dNTPs 2μL、P22μL，70℃作用5min然后，向體系中加入5×RT Buffer 5μL、RNase inhibitor 0.2μL、M-MLV 0.5 μL、DEPC水9.3μL。37℃孵育60min，95℃10 min，4℃10min。PCR體系：10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs 2μL、上下游引物（20pmol／μL）各0.5 μL、cDNA 2μL、Taq DNA polymerase 0.2μL、滅菌雙蒸水16.3μL。PCR程序為：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35個循環；72℃10min。回收PCR產物，將N基因純化后插入到T載體中，將重組質粒送交南京金斯瑞生物科技公司進行序列測定。

1.3.8 序列分析 應用DNAStar軟件對TGEV shaanxi分離株N基因的測序結果與GenBank中已發表的10株TGEV毒株的N基因序列進行核苷酸及氨基酸序列比較分析并繪制系統進化樹。

2 結果

2.1 病毒分離培養 初代病毒液接種PK-15細胞60h時CPE不典型，盲傳至第3代時細胞出現皺縮、變圓、聚堆等現象。傳至第5代時細胞病變達80%，時間穩定在48h～60h，細胞折光性增強，聚集、變圓，形成空斑，逐漸成拉網狀病變，最后成片脫落（圖1）。

圖1 正常PK-15細胞與接毒后60h的PK-15細胞 （100×）

2.2 病毒TCID50及中和試驗測定結果 根據TCID50測定數據（表1）可知，使半數細胞出現CPE的病毒稀釋度（即TCID50）介于1×10-6～1×10-7之間，按Reed-Muench法得出 TCID50為10-6.68／0.1mL。

利用固定病毒稀釋血清法得出，能保護50%細胞的血清稀釋度介于1∶320～1∶640之間。根據Reed-Muech氏法計算標準陽性血清的中和效價為1∶431。而分離毒株與陰性血清作用后CPE沒有被抑制，陽性血清對細胞毒性試驗以及空白試驗細胞正常。

2.3 病毒理化試驗

2.3.1 病毒核酸類型鑒定 采用BUDR法進行病毒核酸類型鑒別，結果對照組TCID50為10-6.68／0.1 mL，試 驗 組 TCID50為 10-6.52／0.1mL，二 者 的TCID50的對數差值小于1，證明病毒的核酸類型為RNA。

2.3.2 氯仿敏感試驗 經氯仿處理的病毒液接種96孔細胞培養板，結果對照組TCID50為10-6.68／0.1mL，試驗組 TCID50為10-3.84／0.1mL，二者的TCID50的對數差值為2.84，說明該病毒對氯仿敏感。

表1 感染TGEV病毒后CPE的出現情況

2.4 分離病毒的RT-PCR鑒定結果 從分離病毒的小腸內容物、病毒細胞培養液和TGEV疫苗毒中均擴增出了約～bp的片段（圖2），與預期大小一致。說明該病毒株為TGEV，命名為TGEV shaanxi株。

2.5 序列分析及進化樹 將所測的N基因序列與GenBank中已發表的10株TGEV毒株的N基因序列進行同源性比較分析。結果表明，TGEV shaanxi株與其他分離的TGEV株之間的同源性很高，核苷酸同源性為94.3%～98.3%，氨基酸同源性為95.6%～99.4%。系統發生進化樹（圖3）分析表明，TGEV shaanxi株與HN2002株親緣關系較近，處于同一分支。

圖2 病毒RT-PCR鑒定

3 討論

圖3 TGEV shaanxi分離株與TGEV參考毒株N基因系統發生進化樹分析

TGEV可在多種細胞系如豬睪丸細胞（ST細胞）、豬腎細胞（PK-15細胞、IBRS-2細胞）、豬甲狀腺細胞等多種細胞上生長。本試驗選用了PK-15細胞進行病毒分離，病毒很快適應PK-15細胞，產生典型的細胞病變：細胞皺縮、聚集、拉網、脫落，胞漿內形成空泡等。隨著病毒作用時間的延長，細胞幾乎全部脫落。TGEV有4種結構蛋白，分別為纖突糖蛋白（S蛋白）、膜內在蛋白（M蛋白）、核衣殼蛋白（N蛋白）和小膜蛋白（sM蛋白）［7］。其中核衣殼蛋白基因（N）是TGEV主要結構蛋白基因，可與基因組RNA組裝成核糖核蛋白復合物摻入病毒粒子中［8-9］。N蛋白不僅在病毒致病性、轉錄和翻譯及增強細胞免疫等方面起到重要作用，而且具有輔助增強病毒RNA復制的能力。比較分離株N基因與GenBank中其他TGEV N基因序列，發現N基因高度保守，核苷酸同源性為94.3%～98.3%，氨基酸同源性為95.6%～99.4%，表明陜西分離株與其他分離的TGEV株之間的同源性很高。系統發生進化樹分析表明，TGEV shaanxi株與HN2002株親緣關系較近，處于同一分支，表明我國不同地區分離毒株的N基因差異不大。

本試驗通過病毒分離、細胞培養、核型鑒定、氯仿敏感性試驗、RT-PCR鑒定、序列分析等從陜西省發生腹瀉的仔豬小腸內容物及腹瀉糞便中分離到1株豬傳染性胃腸炎病毒，命名為TGEV shaanxi株。測定的病毒TCID50顯示該毒株在體外培養增殖性能穩定，病毒滴度高。豬傳染性胃腸炎病毒shaanxi株的成功分離對陜西地區該病的病原學研究、流行病學調查、診斷和防制具有重要意義，也為今后開展TGEV流行病學、分子病毒學、疫苗免疫及診斷研究提供有價值的毒株。

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