環(huán)介導等溫擴增技術(shù)快速檢測豬細小病毒的試驗

黃書林，付 萍，李佳禾，張躍偉，蔣 菲，張 侃，陳會玲，吳文學

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 海淀 100193；2.中國牧工商（集團）總公司中牧研究院，北京 豐臺 100070）

豬細小病毒病是由豬細小病毒（PPV）感染引起母豬繁殖障礙的重要病原體之一，主要引起母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、畸形胎、木乃伊胎及不孕等。近年來，豬細小病毒病有上升的趨勢，并且該病常常與豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒，偽狂犬病病毒等發(fā)生混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失［1-2］。

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）作為一種新興的核酸擴增技術(shù)［3］，具有高特異性、高敏感性、快速、簡便等優(yōu)點［4-6］。本試驗針對豬細小病毒NS-1基因設(shè)計引物，建立了豬細小病毒LAMP檢測方法。

1 材料與方法

1.1 毒株及病料來源 豬細小病毒7909株、NADL-2株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬繁殖與呼吸綜合征病毒標準株（VR-2332）、豬偽狂犬病病毒Bartha-K61株、豬瘟病毒（C株）、弓形蟲（RH株）的核酸樣品，由本實驗室制備保存。疑似PPV感染流產(chǎn)胎兒組織病料采自北京周邊地區(qū)、山東濰坊等地規(guī)模化豬場。

1.2 方法

1.2.1 核酸DNA的提取 采用基因組DNA提取試劑盒（TransGen）提取PPV 7909株、NADL-2株的細胞培養(yǎng)物和組織樣本DNA，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 LAMP引物的設(shè)計 在GenBank下載了NS-1基因全長序列，利用生物學軟件DNAStar的MegAlign軟件進行同源性比對分析，選取NS-1基因同源性高即保守區(qū)域，使用在線LAMP引物設(shè)計軟件設(shè)計并篩選出PPV特異的6條引物（表1及圖1）。

表1 所設(shè)計的引物

圖1 豬細小病毒LAMP各引物的名稱與順序和各引物在基因組中對應(yīng)的位置

1.2.3 LAMP反應(yīng)的建立 參照日本榮研株式會社生產(chǎn)LAMP試劑盒，優(yōu)化后的25μL反應(yīng)體系為：4μL Tris-HCl（125mmol／L），2μL MgSO4（100mmol／L），2μL KCl（125mmol／L），2μL（NH4）2SO4（125mmol／L），0.4μL Betaine（50 mol／L），0.025μL 0.2%Tween 20，dNTPs（100 mmol／L）各0.3μL，12UBst DNA 聚合酶（New England Biolabs），此外，體系中引物 FIP（40 mmol／L）、BIP（40mmol／L）、F3（5mmol／L）、B3（5 mmol／L）、LF（20mmol／L）、LB（20mmol／L）各1 μL，2μL模板DNA，加雙蒸水至25μL。

反應(yīng)通過LA-200實時濁度儀（Teramecs，Japan）進行實時監(jiān)測。反應(yīng)產(chǎn)物若經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)典型“梯形”條帶，則判定為陽性。置于LA-200實時濁度儀（日本）中63℃恒溫反應(yīng)，可實時監(jiān)測反應(yīng)液的濁度變化。以反應(yīng)液濁度達到0.1判為陽性。反應(yīng)45min結(jié)束，以檢量曲線的形式展示反應(yīng)結(jié)果。同時，反應(yīng)產(chǎn)物還通過2%葡萄糖瓊脂凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 PCR反應(yīng) 以豬細小病毒NS-1基因（Gen-Bank登錄號：NC-001718）為靶序列設(shè)計PCR引物。上游引物：5′-TAGGATGCGAGGAAAGAC-3′，下游引物：5′-GGAGTTAAGTGCAGGTTG-3′，擴增產(chǎn)物大小為400bp。25μL PCR反應(yīng)體系，包括12.5μL 2xTaq PCR SuperMix（TransGen），上下游引物（25μmol／L）各0.6μL，2μL模板DNA，加雙蒸水至25μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，之后94℃變性45s，54℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.5 LAMP與PCR的敏感性 本試驗針對LAMP和PCR檢測的共同擴增區(qū)域序列構(gòu)建重組質(zhì)粒。以豬細小病毒NADL-2株DNA為模板，使用上述1.2.4中的PCR方法進行擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物（400bp）連接于pEASY-T1Cloning Vector載體（TransGen），構(gòu)建含有目標片段的重組質(zhì)粒，經(jīng)分光光度計法測定并計算質(zhì)粒的拷貝數(shù)濃度，進行10倍連續(xù)倍比稀釋，使質(zhì)粒在反應(yīng)體系中的分布為106～100個拷貝／25μL，取一定量質(zhì)粒，分別進行LAMP和PCR檢測。

1.2.6 LAMP與PCR特異性 將豬繁殖與呼吸綜合征病毒標準株（VR-2332）、豬偽狂犬病病毒Bartha-K61株、豬瘟病毒（豬瘟兔化弱毒株，C株）和弓形蟲（RH株）作為模板，分別進行LAMP和PCR方法的特異性檢測。

1.2.7 熒光指示劑的應(yīng)用［4］將反應(yīng)體系中加入含有0.625mmol／L鈣黃綠素和 Mn2+3.75mmol／L的熒光指示劑2μL。將105.0TCID50／100μL的PPV 7909株細胞病毒液提取全基因組DNA作為模板，經(jīng)63℃恒溫反應(yīng)45min，反應(yīng)結(jié)束后觀察溶液顏色變化。

1.2.8 臨床樣本檢測 采集疑似病例的流產(chǎn)胎兒組織149份，-20℃保存。稱取適量組織樣本按w／v為1∶1加入0.9%氯化鈉溶液，經(jīng)研磨后，提取組織樣本全基因組DNA。用已建立的LAMP和PCR方法檢測，比較兩種方法的陽性檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP和PCR的敏感性 設(shè)定反應(yīng)產(chǎn)物濁度值超過0.1時，即作為陽性判定。敏感性試驗顯示，LAMP方法能在60min內(nèi)檢測出10個拷貝質(zhì)粒（圖2A），PCR方法僅能檢測到103拷貝質(zhì)粒（圖2B）。表明建立的LAMP方法的檢測極限高于PCR方法100倍。

2.2 LAMP與PCR的特異性 利用2株豬細小病毒和其他4株病原來檢測LAMP和PCR方法的特異性。結(jié)果顯示，兩種方法能特異性擴增豬細小病毒兩種毒株，而其他病原均無特異性擴增（圖3）。表明兩種方法都有很好的特異性。

2.3 熒光指示劑的應(yīng)用 顯色試驗結(jié)果表明，在反應(yīng)體系中加入含有鈣黃綠素與Mn2+的作為熒光指示劑，陽性樣品由棕黃色變?yōu)榱辆G色，反應(yīng)前后顏色變化及陰陽性對比明顯，說明該熒光指示劑可用于判定LAMP反應(yīng)結(jié)果（圖4）。

圖4 熒光指示劑在LAMP的可視化應(yīng)用

2.4 臨床樣本的檢測 用LAMP和PCR方法檢測149份流產(chǎn)胎兒組織樣本DNA。結(jié)果（表2）表明，LAMP方法陽性檢出率22.1%（33／149），高于PCR方法的陽性檢出率18.1%（27／149）。

表2 臨床檢測結(jié)果（n=149）

3 討論

目前已有常規(guī)PCR、多重PCR、Real-time PCR和Nest-PCR等方法檢測細小病毒，且多選擇高度保守的NS-1基因作為檢測的靶基因［7-8］。在本文中，我們同樣選取了該基因上的保守區(qū)域設(shè)計了數(shù)套引物，并通過陰性和陽性篩選，獲得1套高效、特異LAMP引物，建立了最佳反應(yīng)體系。

試驗發(fā)現(xiàn)，該方法能在63℃的恒溫反應(yīng)45min即可判定結(jié)果。敏感性試驗表明，LAMP方法最低能檢出10個拷貝數(shù)的PPV基因組，相當于0.1 TCID50／100μL，比常規(guī)PCR方法高100倍，與先前報道的該病原的LAMP方法靈敏度相當［8-9］。對多種病原基因組進行檢測，無交叉反應(yīng)，顯示良好的特異性。此外，通過對149份臨床樣本檢測，結(jié)果證明，LAMP的陽性檢出率（22.1%）要高于PCR方法（18.1%），也進一步證明了LAMP具有更高的靈敏度。因此，可確定本試驗建立的LAMP方法適用于PPV檢測的高敏感性和特異性的方法。

為了避免氣溶膠造成假陽性的問題，我們通過在反應(yīng)前體系中加入鈣黃綠素，反應(yīng)結(jié)束后肉眼觀察其顏色變化即可快速判定結(jié)果，這使得LAMP方法在臨床檢驗上具有廣闊的應(yīng)用前景，為早期診斷、防制和凈化提供了一種新方法。

［1］Woodbine K A，Medley G F，Slevin J，et al.Spatiotemporal patterns and risks of herd breakdowns in pigs with postweaning multisystemicwasting syndrome［J］.Vet Rec，2007，160：751-762.

［2］Kim J，Chae C.A comparison of the lymphocyte subpopulations of pigs experimentally infected with porcine circovirus 2 and／or parvovirus［J］.Vet J，2003，165：325-329.

［3］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Research，2000，28（12）：63.

［4］張躍偉，李旭妮，郭盼盼，等.熒光顯色在環(huán)介導等溫擴增（LAMP）檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的應(yīng)用［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2010，18（3）：508-513.

［5］李佳禾，李一婧，付萍，等.豬胸膜肺炎放線桿菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立與應(yīng)用［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2009，17（6）：948-953.

［6］郭盼盼，黃書林，張躍偉，等.環(huán)介導等溫擴增技術(shù)快速診斷豬肺炎支原體［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2010，18（4）：822-826.

［7］Ana I R，Juan J M，Esmeralda D A，et al.Porcine parvovirus：DNASequence and Genome Organization［J］.Gen Virol，1989，70：2541-3255.

［8］Chen C M，Cui S J.Detection of porcine parvovirus by loopmediated isothermal amplification［J］.Journal of Virological Methods，2009，155（2）：122-125.

［9］Chen H T，Zhang J，Yang S H，et al.Rapid detection of porcine parvovirus DNA by sensitive loop-mediated sothermal amplification［J］.Journal of Virological Methods，2009，158（1-2）：100-103.