痛風(fēng)顆粒HPLC指紋圖譜研究Δ

徐玲玲，徐 熠，年 華（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海市 200437）

痛風(fēng)顆粒由茵陳、連錢草、伸筋草等藥物組成，具有清熱、利濕、通絡(luò)的作用，常用于治療慢性痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎等癥，臨床療效顯著。方中以茵陳作為君藥，取其清利濕熱、芳香舒脾、透表暢氣之效；以連錢草作為臣藥，取其消石之功，防止痛風(fēng)性尿路結(jié)石的產(chǎn)生，配伍茵陳可以增強其利濕通絡(luò)的作用；加之伸筋草祛風(fēng)除濕、舒筋活血，達到通絡(luò)的作用。該方中主要含有綠原酸[1]、黃酮[2]、石松堿[3]等多種化學(xué)成分，多靶點地對慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎起到治療效果[4]。目前，單對一種成分進行質(zhì)量控制已經(jīng)達不到有效控制和評價中藥復(fù)方制劑的目的。因此，本試驗對痛風(fēng)顆粒進行高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究，以期為痛風(fēng)顆粒的質(zhì)量控制研究提供思路。

1 儀器與試藥

1200型HPLC儀（美國Agilent公司）；BS124S電子天平（德國Sartorius公司）；B5200S-DT超聲提取器（必能信超聲（上海）有限公司）。

綠原酸對照品（批號：0753-200111）、伸筋草（批號：121109-200401）、茵陳（批號：950-200204）均由中國藥品生物制品檢定所提供；連錢草（上海同濟堂藥業(yè)有限公司，批號：090801，經(jīng)上海中藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗室葉愈青副主任藥師鑒定為真品）；甲醇（色譜純，批號：Lot.096964）、乙腈（色譜純，批號：Lot.100751）均購自美國Fisher Scientific公司；異丙醇（分析純，美國TEDIA公司，批號：Lot.909904）；磷酸為分析純，水為雙蒸水；痛風(fēng)顆粒（上海上聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號：081001、090501、090502、090701、090722、090901、091001、091101、100101、100401）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 min，4%B；20 min，80%B；40 min，32%B；50 min，36%B；50～55 min，4%B）；柱溫：20 ℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL；檢測波長：327 nm。

2.2 對照品溶液的制備

取綠原酸對照品適量，用甲醇溶解稀釋成64 μg·mL-1的對照品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取痛風(fēng)顆粒2.5 g，精密稱定，研細，置于具塞錐形瓶中，加50%甲醇超聲（工作頻率：42 kHz，功率：260 W）30 mim，過濾，取續(xù)濾液5 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 圖譜測定時間的確定 取供試品溶液進樣10 μL，按上述色譜條件進行梯度洗脫，記錄120 min。結(jié)果，40 min后無有意義峰出現(xiàn)，故圖譜測定時間確定為55 min。

2.4.2 參照物的確定 痛風(fēng)顆粒的處方藥材含有機酸、黃酮、生物堿等多種有效成分。通過對供試品和對照品的圖譜比較（見圖1），綜合考慮出峰面積、出峰時間及分離度等因素，發(fā)現(xiàn)綠原酸在制劑中的含量最高、色譜峰分離度較好且純度較高，因此采用綠原酸作為參照物。

圖1 供試品溶液和綠原酸對照品溶液的HPLC對照圖譜Fig 1 HPLC chromatograms of test sample and chlorogenic acid control

2.4.3 精密度試驗 精密稱取痛風(fēng)顆粒（批號：090722）2.5 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)重復(fù)進樣6次，記錄指紋圖譜并分析。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD為0.00%～0.20%，相對峰面積的RSD為0.00%～2.89%，相似度為0.999～1，表明本方法精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 精密稱取痛風(fēng)顆粒（批號：090722）適量，共6份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣，記錄并分析。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD為0.00%～0.09%，相對峰面積的RSD除4、14～17號峰外，均＜3%，相似度為0.999～1，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱取痛風(fēng)顆粒（批號：090722）適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、24 h進樣，記錄并分析。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD為0.00%～0.47%，相對峰面積的RSD除10～11、13、16、19～21號峰外，均＜3%，相似度為0.998～1，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品指紋圖譜測定

取10批痛風(fēng)顆粒各適量，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣，記錄，比較色譜圖（見圖2、圖3），確定共有峰為21個。

圖2 痛風(fēng)顆粒的HPLC圖Fig 2 HPLC chromatograms of Tongfeng granules

圖3 10批痛風(fēng)顆粒的HPLC指紋圖譜Fig 3 HPLC fingerprints of 10 batches of Tongfeng granules

2.6 相似度計算

采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A版）》軟件對10批樣品進行相似度分析。以S1為參照得出對照指紋圖譜，以此為基礎(chǔ)進行整體相似度評價。結(jié)果，相似度評價結(jié)果均＞0.9（見表1），表明10批樣品中的化學(xué)成分較一致。

2.7 指紋圖譜共有峰的歸屬

按痛風(fēng)顆粒制備工藝，分別制備茵陳、連錢草和伸筋草藥材的供試品溶液，按已建立的指紋圖譜色譜條件進行檢測，與痛風(fēng)顆粒的全圖譜進行比較。結(jié)果表明，在痛風(fēng)顆粒指紋圖譜21個峰中，有16個峰歸屬茵陳（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、18、19、20），其中4、11號峰為茵陳特征峰；11個峰歸屬連錢草（1、2、3、7、8、10、13、14、15、20、21），其中14、15、21號峰為連錢草的特征峰；11個峰歸屬伸筋草（1、2、5、6、7、9、10、12、13、16、17），其中16、17號峰為伸筋草的特征峰。

表1 痛風(fēng)顆粒的指紋圖譜相似度Tab 1 Similarity degree of the fingerprints of Tongfeng granules

3 討論

3.1 色譜柱的確定

由于不同型號和不同廠家的色譜柱存在填料及性能上的差異，會影響試驗結(jié)果，因此對J’sphere ODS-H80（150 mm×4.6 mm，5 μm，日本YMC公司）、ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫公司）和ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫公司）3種色譜柱進行比較。結(jié)果表明，J’sphere ODS-H80和ZORBAX SB-C18的出峰效果優(yōu)于ZORBAX Eclipse XDB-C18，且所出峰較多；而ZORBAX SB-C18各峰的分離度優(yōu)于J’sphere ODS-H80，因此采用ZORBAX SB-C18作為試驗用色譜柱。

3.2 流動相的確定

本試驗考察了甲醇-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-水、甲醇-1%醋酸水溶液、乙腈-1%醋酸水溶液作為流動相的分離效果。結(jié)果，由于乙腈-0.05%磷酸水溶液的分離度較佳，故最后選其作為試驗用流動相。

3.3 柱溫的確定

分別在20、30、40℃的柱溫條件下對樣品的分離效果進行考察。結(jié)果表明，隨著柱溫的升高，各色譜峰的出峰時間明顯提前。在30與40℃柱溫條件下，17～25 min區(qū)間的幾組峰的分離效果較20℃柱溫條件下更差，故采用20℃柱溫作為試驗條件。

3.4 檢測波長的確定

試驗考察了327、254、280 nm波長條件下可獲取的色譜圖。結(jié)果表明，痛風(fēng)顆粒中的成分在327 nm波長條件下有較好的響應(yīng)。比較各個峰的吸收波長，發(fā)現(xiàn)均在320～330 nm區(qū)間有最佳吸收，因此選用327 nm作為檢測波長。

3.5 提取溶劑的考察

分別采用70%乙醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇作為提取溶劑，進行色譜圖比較。結(jié)果表明，70%乙醇與70%甲醇比較，70%甲醇的提取成分較多，提取率較高，因此采用甲醇作為提取溶劑；再比較70%、50%、30%甲醇提取的圖譜，發(fā)現(xiàn)50%和30%甲醇的提取效果明顯優(yōu)于70%甲醇的提取效果，而50%甲醇提取效果要略高于30%甲醇，因此采用50%甲醇作為提取溶劑。

3.6 方法評價

本試驗以綠原酸作為參照物，對痛風(fēng)顆粒進行HPLC指紋圖譜研究，可以完整、全面地反映痛風(fēng)顆粒的質(zhì)量。本研究所建立的方法可以有效、快速地對痛風(fēng)顆粒的質(zhì)量進行評價，并為該制劑的質(zhì)量控制提供借鑒。

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