雞骨草醇提物對大鼠非酒精性脂肪肝的保護作用研究

黃凱文，陳劍梅，蘇寧，郭潔文，梁錦詩，劉若軒，吳偉文（.南方醫科大學附屬順德第一人民醫院，佛山市 5800；.廣州市中醫醫院，廣州市 500；.廣州中醫藥大學，廣州市 50405）

非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精外和其他明確損肝因素（如遺傳-環境-代謝-應激相關因素等）所致的、以彌散性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征的臨床病理綜合征，目前NAFLD全球發病率為20%～33%，由肥胖或2型糖尿病所致達75%，且有逐年增加的趨勢[1，2]，目前對其尚無有效治療藥物。有研究[3]表明，雞骨草具有利濕退黃、清熱解毒、疏肝止痛之功效，本研究采用高脂飲食-四氯化碳（CCl4）復制脂肪肝大鼠模型，觀察雞骨草醇提物對病鼠肝功能和脂肪肝的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7170型全自動生化分析儀型（日本日立公司）；TB1020型切片機、RM2135型脫水機（德國Leica公司）；CX21型顯微鏡（日本Olympus公司）；RE252A型旋轉蒸發儀（西安德派生物科技有限公司）。

1.2 試藥

雞骨草（廣州致信藥業有限公司，批號：090110）經廣東省藥物研究所中藥藥理室邱光清教授鑒定為真品；CCl4（上海聯試化工試劑有限公司，批號：000220）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒（批號：090121）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒（批號：090116）均由上海北海生物技術工程有限公司提供。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，♀♂兼半，體重180～200 g，購自廣州中醫藥大學動物實驗中心（動物合格證號：0067696）。

2 方法

2.1 試藥的制備

用FW100型高速萬能粉碎機粉碎雞骨草，取20 g粉末置于索氏提取器中，加200 mL75%的乙醇在90℃水浴中回流提取3 h，取出提取液，再次用200 mL75%的乙醇在90℃水浴中回流提取3 h，合并提取液，用旋轉蒸發儀將提取液濃縮至20 mL，即為試藥（液）；40%CCl4橄欖油溶液。

2.2 模型的復制和分組、給藥

參照文獻[4]將50只SD大鼠隨機分為正常對照（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）和雞骨草醇提物高、中、低劑量（40、30、20 g·kg-1）組。正常飼養1周后開始復制模型。正常對照組常規飼養，模型和雞骨草醇提物高、中、低劑量組大鼠于第1～2周給予高脂低蛋白飼料（79.5%玉米粉、20%豬油、0.5%膽固醇）飼養，并配合CCl4溶液sc。首次以純CCl4溶液5 mL·kg-1sc，其后用40%CCl4橄欖油溶液3 mL·kg-1sc，每周2次，連續2周。此后，所有大鼠均采用普通飼料喂養，自由飲食。復制模型成功后，ig給藥，每天1次，連續2周。于末次給藥后禁食不禁水24 h，稱大鼠體重，眼眶靜脈叢采血，低速離心后取血清，－20℃貯藏，備用。全自動生化儀檢測血清中AST、ALT含量。隨后斷頸處死大鼠，取肝臟，吸干表面血液后稱重，計算肝臟系數；取肝左葉同部位肝組織1塊（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm），置于4%多聚甲醛中固定，做常規HE染色，光鏡下進行病理形態學觀察。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 動物存活情況

除正常對照組外，其余各組大鼠在復制模型過程中出現精神萎靡、活動減少、食欲下降、皮毛欠光滑、體重增長緩慢等，50只大鼠共死亡7只，其中喂養過程中ig死亡3只，嚴重肝損傷致死4只，最后存活大鼠數量為：正常對照組9只，模型組8只，雞骨草醇提物低劑量組8只，雞骨草醇提物中劑量組9只，雞骨草醇提物高劑量組7只，其病死率分別為10%、20%、20%、10%、30%。

3.2 雞骨草醇提物對模型大鼠血液生化指標的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，雞骨草醇提物高、中、低劑量組大鼠血液AST、ALT含量顯著降低，AST/ALT值顯著升高（P＜0.01），提示雞骨草醇提物可降低CCl4+高脂飲食誘導的脂肪肝大鼠血清中AST、ALT活性，減輕肝細胞損傷程度。雞骨草醇提物對CCl4致大鼠脂肪肝血清AST、ALT含量的影響見表1。

表1 雞骨草醇提物對CCl4致大鼠脂肪肝血清AST、ALT含量的影響（±s）Tab 1 Influence of ethanol extraction of A.cantoniensis on the serum levels of AST and ALT in rats with fatty liver induced by CC（l4±s）

表1 雞骨草醇提物對CCl4致大鼠脂肪肝血清AST、ALT含量的影響（±s）Tab 1 Influence of ethanol extraction of A.cantoniensis on the serum levels of AST and ALT in rats with fatty liver induced by CC（l4±s）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

組別正常對照組模型組雞骨草醇提物低劑量組雞骨草醇提物中劑量組雞骨草醇提物高劑量組n 9 8 8 9 7劑量/g·kg-1-- 2 0 30 40 AST/U·L-1 137.50±19.60 184.27±16.37＊139.43±23.55#135.67±14.12#134.15±32.87#ALT/U·L-1 36.20±14.85 68.20±13.51＊40.14±10.64#38.96±6.50#37.86±6.58#AST/ALT 3.79±0.59 2.70±0.64＊3.47±0.67#3.48±0.62#3.54±0.94#

3.3 雞骨草醇提物對脂肪肝大鼠肝臟系數的影響

肝臟系數＝肝臟重量/大鼠體重（g）×100%。與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟系數顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，雞骨草醇提物高、中、低劑量組均能顯著降低大鼠肝臟系數（P＜0.05）。雞骨草醇提物對CCl4致大鼠脂肪肝的肝臟系數的影響見表2。

表2 雞骨草醇提物對CCl4致大鼠脂肪肝的肝臟系數的影響（±s）Tab 2 Influence of ethanol extraction of A.cantoniensis on liver index in rats with fatty liver induced by CC（l4±s）

表2 雞骨草醇提物對CCl4致大鼠脂肪肝的肝臟系數的影響（±s）Tab 2 Influence of ethanol extraction of A.cantoniensis on liver index in rats with fatty liver induced by CC（l4±s）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別正常對照組模型組雞骨草醇提物低劑量組雞骨草醇提物中劑量組雞骨草醇提物高劑量組n 9 8 8 9 7劑量/g·kg-1 2 mL·kg-1 2 mL·kg-1 20 30 40肝臟系數0.028±0.003 0.039±0.003＊0.034±0.002#0.032±0.003#0.031±0.004#

3.4 大鼠肝組織形態學觀察

與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟發生不同程度的肝細胞損傷及脂肪變性，肝小葉結構破壞嚴重，肝細胞胞漿內有大量脂肪空泡。與模型組比較，雞骨草醇提物高、中、低劑量組大鼠肝細胞胞漿內脂肪空泡明顯減少，肝小葉結構比較清楚，肝細胞索基本正常，提示雞骨草可減輕肝細胞損傷及脂肪變性程度。大鼠肝組織形態學見圖1。

圖1 大鼠肝組織形態學觀察（×200）Fig 1 Histomorphological observation of rats liver（×200）

4 討論

NAFLD是由于過量脂肪向肝細胞內滲透、堆積形成脂肪浸潤變化，“二次打擊”學說是其較為公認的發病機制，“初次打擊”是胰島素抵抗導致肝臟的脂肪沉積，“二次打擊”是在此基礎上發生的氧化應激和脂質過氧化損傷導致肝臟炎癥，脂肪性肝炎的持續存在或其他因素的打擊可造成肝臟細胞外基質合成大于降解，形成進展性纖維化[5，6]。CCl4在肝內經細胞色素P450分解活化，生成2個活性自由基及一系列氧活性物，誘導膜系統發生脂質過氧化反應，大量降解膜磷脂，破壞生物膜結構的完整性，增高膜的通透性，肝細胞中的AST、ALT大量進入血液[7]。

雞骨草成分復雜，具有降血脂、抗脂肪肝、護肝、利膽、抗菌、抗炎、鎮痛、增強免疫、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤和抗輻射等藥理作用，臨床主要用于治療各類肝膽疾病，對急慢性肝炎、病毒性肝炎、膽囊炎、膽石癥、脂肪肝均有良效[8]。本研究結果亦顯示其能降低病大鼠血清中AST、ALT含量及肝臟系數，減輕其肝細胞損傷及脂肪變性程度，具有較強的抗肝損傷及緩解肝臟脂肪沉積的作用，證實雞骨草可改善高脂飼料+CCl4所致大鼠的脂肪肝，但有關其有效部位或成分、藥理作用機制和量效關系等尚需作進一步研究。

[1] 中華醫學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組.非酒精性脂肪性肝病診療指南[J].實用肝臟病雜志，2007，10（1）：11.

[2] Atul Luthra，Priyanka Nigam，Anoop Misra.Metabolic correlation and management strategies of non-alcoholic fatty liver disease：an Asian Indian perspective[J].Diabetes and Metabolic Syndrome：Clinical Research and Reviews，2007，4（1）：279.

[3] 陳曉白，莫志賢，甘耀坤，等.毛雞骨草對高脂血癥模型大鼠血脂和肝脂的影響[J].中國藥房，2010，21（3）：202.

[4] 劉 鋒，向志鋼，許繼凡，等.高脂飼料結合CCl4誘導小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立[J].江蘇醫藥，2010，36（1）：69.

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[7] 張錦雀，黃麗英.肝損傷動物模型研究進展[J].福建醫科大學學報，2009，43（1）：86.

[8] 馬養民，張志偉.構樹屬植物黃酮類化合物及其藥理作用研究進展[J].時珍國醫國藥，2009，20（3）：733.