齊齊哈爾周邊地區(qū)仔豬腸道乳酸桿菌的分離與鑒定

劉 宇

（黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

乳酸桿菌（Lactic acid bacteria, LAB）是仔豬腸道正常微生物區(qū)系中的優(yōu)勢菌群，可利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，有的還產(chǎn)生乙酸及其他揮發(fā)性脂肪酸，對致病菌具有很好的抑制作用，對維持仔豬腸道微生物區(qū)系平衡和消化機能起著重要作用。乳酸桿菌是指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性桿菌的總稱。厭氧或兼性厭氧，大多數(shù)不運動，少數(shù)以周毛運動。菌體形態(tài)多樣，直或彎的桿菌，通常單生或排列成鏈。

豬用益生菌制劑是一類通過改善豬腸道的微生態(tài)平衡對宿主動物產(chǎn)生有益作用的活菌制劑。我國應用的微生態(tài)制劑菌株大概有6種，即乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、糞鏈球菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌和酵母菌。對于豬來說，豬的品種不同優(yōu)勢菌群也有差異。選擇特異的優(yōu)勢菌株是研制豬用益生菌制劑的關鍵。

目前，乳酸桿菌配合其他益生菌制成的益生菌制劑已廣泛應用于臨床，替代抗生素預防和治療仔豬消化道疾病，但效果好壞不一。由于動物腸道菌群存在動物種屬和地域的特異性，一種適于某地域某類動物的微生態(tài)制劑不一定適于另一類動物。所以，本研究擬從齊齊哈爾周邊地區(qū)健康仔豬腸道中分離篩選出乳酸桿菌，用來研制高效、專一的豬用乳酸桿菌微生態(tài)制劑。

1 材料與方法

1.1 材料2

1.1.1 樣品來源

在齊齊哈爾周邊地區(qū)部分豬場，選定21～35日齡長白、大白、杜洛克、二元及三元健康仔豬，用滅菌棉簽蘸取剛排出的新鮮糞樣，共采集糞樣20份。置于滅菌試管中，冷藏并迅速送實驗室進行細菌分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

采用液體和固體MRS培養(yǎng)基（由北京陸橋技術有限責任公司生產(chǎn)），用于乳酸桿菌的分離培養(yǎng)。MRS液體培養(yǎng)基成分：蛋白胨10 g；牛肉浸膏10 g；酵母浸膏5 g；葡萄糖20 g；檸檬酸三銨2 g；醋酸鈉5 g；K2HPO45g；MgSO4·7H2O 0.5 g；MnSO4·4H2O 0.2 g；吐溫-80 1 g；蒸餾水加至1 000 mL。調(diào)pH值5.5～6.2，115℃滅菌20 min。在液體MRS中加入瓊脂（1.8%～2%），為固體MRS。

1.1.3 生化管及試劑

細菌鑒定用生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司，生理鹽水，無水乙醇及甘油等均為分析純試劑。

1.1.4 主要儀器設備

厭氧培養(yǎng)箱（YQX-Ⅱ型）；超靜工作臺（BCN-1360 B型）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DRP-9272型）；電熱恒溫水浴鍋（DK-S12型）；電子天平 FA1104等。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理

將采集的仔豬糞樣置于盛有50 ml滅菌生理鹽水含玻璃珠的錐形瓶中。將錐形瓶置于搖床振蕩5 min（180 r/min），然后進行10倍系列稀釋，自10-1至10-9，共9個稀釋度。

1.2.2 菌株分離、染色和鏡檢

分別取10-7至10-9三個稀釋度的糞樣混懸液各0.l mL涂布于2塊MRS平板，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24～48 h。挑取各種不同菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

1.2.3 菌株的純化

挑取MRS瓊脂培養(yǎng)基平板上的疑似菌落進行純化，純化好的菌株進行菌落形態(tài)觀察，并描述各菌株的菌落形態(tài)特征。

1.2.4 分離菌生化鑒定

按照乳酸桿菌屬和種的生理生化鑒定指標，分別進行厭氧生長試驗、運動性試驗，過氧化氫酶試驗，硝酸鹽還原試驗，明膠液化試驗，吲哚試驗。若厭氧生長試驗為陽性，其他均為陰性，可初步定為乳酸桿菌屬。再進行糖醇類發(fā)酵產(chǎn)酸試驗（阿拉伯糖、葡萄糖、葡萄糖酸鹽、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、棉籽糖、甘露醇、松三糖、核糖、山梨醇、蔗糖、木糖、七葉苷、水楊素），結果與《伯杰細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌的分類鑒定及實驗方法》對照，從而進行乳酸桿菌種的鑒定。

2 結果

2.1 菌落形態(tài)特征

通過厭氧分離純化，共獲得革蘭氏陽性，無芽孢桿菌12株，其中菌株SY1和SY2菌落形態(tài)基本相同，均為圓形、邊緣不整齊、表面粗糙、扁平、灰白色菌落，菌落直徑1.0～2.0mm；菌株DYF3 和DYF4為圓形、邊緣整齊、表面光滑、白色菌落，菌落直徑1.0～2.0mm。

2.2 染色特性

對分離出的所有菌株進行了革蘭氏染色，其中12株為革蘭氏染色陽性無芽孢桿菌，長短不一，單個、成對、個別排列呈短鏈狀。

2.3 菌株的生理生化鑒定結果

2.3.1 乳酸桿菌屬的鑒定結果

通過厭氧生長試驗、運動性試驗，過氧化氫酶試驗，硝酸鹽還原試驗，明膠液化試驗，吲哚試驗等7個鑒定指標，共4個菌株符合乳酸桿菌屬的鑒別特征。可以初步確認為乳酸桿菌屬。具體結果見表1。

表1 乳酸桿菌屬鑒定結果

表2 乳酸桿菌種間生化鑒定結果

2.3.2 乳酸桿菌種間鑒定結果

乳酸桿菌種的鑒定主要是進行糖醇類發(fā)酵產(chǎn)酸試驗，在本研究中共應用了15種糖醇。其中SY1和SY2兩株乳酸桿菌有14種糖醇發(fā)酵產(chǎn)酸的鑒定結果符合嗜酸乳桿菌的鑒別特征，僅木糖不完全相符，可確定這2株乳酸桿菌為嗜酸乳桿菌；菌株SY3僅松三糖和甘露醇不完全符合干酪乳桿菌假植物亞種鑒別特征，可確定其為干酪乳桿菌；菌株SY4僅山梨醇不完全符合植物乳桿菌鑒別特征，可確定其為植物乳桿菌。具體結果見表2。

3 結論

在齊齊哈爾周邊地區(qū)部分豬場采集的健康仔豬糞樣中，共分離得到了乳酸桿菌4株。其中嗜酸乳桿菌2株，干酪乳桿菌1株，植物乳桿菌1株；

近年來，國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)行情處于下降趨勢，近半年來更是走入低谷，再加之飼養(yǎng)管理及眾多豬病的影響，對養(yǎng)殖戶經(jīng)濟收入造成了巨大的影響。而隨著國家積極調(diào)控及養(yǎng)殖戶的不斷努力，相信養(yǎng)豬業(yè)行情在不久后會有所回暖。而眾多的影響因素中，仔豬腹瀉是影響豬只出欄時間，出欄重及料重比關鍵因素之一，目前，防治仔豬腹瀉以使用抗生素為主，但長期、大量使用不僅造成藥物殘留，促進耐藥菌株的產(chǎn)生，而且會打破宿主菌群平衡。益生菌制劑以其天然、無殘留、安全可靠及不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點而成為抗生素的替代品，是國內(nèi)外研究的熱點。本研究在齊齊哈爾周邊地區(qū)部分豬場采集的健康仔豬糞樣中分離乳酸桿菌，并通過形態(tài)學結合生理生化鑒定方法進行乳酸桿菌書間鑒定。結果表明，齊齊哈爾周邊地區(qū)仔豬腸道中乳酸桿菌種類主要以嗜酸乳桿菌為主。

目前，國內(nèi)一些豬用乳酸桿菌微生態(tài)制劑的生產(chǎn)菌株多是從人和哺乳動物腸道中或土壤中分離得到的，并非豬源乳酸桿菌制劑。由于動物腸道菌群的生成是長期進化的結果，一種適于某類動物的微生態(tài)制劑不一定適于另一類動物。此外，有研究結果表明，許多從雞分離的乳酸桿菌只對雞小腸粘膜上皮細胞有粘附力，而對大白鼠和豬等則沒有粘附力。本研究鑒定得到的4株乳酸桿菌，均分離自齊齊哈爾周邊地區(qū)健康仔豬腸道，具有地區(qū)特異性和物種特異性。通過安全性試驗，耐受力試驗及發(fā)酵條件等試驗，進一步研究這些乳酸桿菌在不同生理環(huán)境中的特性，可篩選適合于生產(chǎn)豬源微生態(tài)制劑的乳酸桿菌菌株。為研發(fā)適用于齊齊哈爾市周邊地區(qū)的豬用益生菌制劑提供科學依據(jù)。