復方米諾地爾酊微生物限度檢查方法學的驗證

李遼閩 曾慶莉

（1 湖北省襄陽市婦幼保健院，湖北 襄陽 441000；2 湖北省黃石市食品藥品監督檢驗所，湖北 黃石 435000）

復方米諾地爾酊為淡黃色至棕褐色的澄清液體。主要成分為生姜、辣椒、米諾地爾等。對斑禿、脂溢性脫發、病后脫發、老年性脫發均有效。因其具有較強的抑菌作用，采用常規實驗方法難以除去其抑菌成分，我們采用薄膜過濾法[1]，按中國藥典2005年版二部相關規定[2]進行試驗，結果表明，該方法省時、易操作，適用于復方米諾地爾酊微生物限度檢查。

1 儀器、試藥和菌種

1.1 生物安全柜、隔水式恒溫培養箱（30～35℃）、生化培養箱（23～28℃）、電熱干燥箱（160～250℃）、立式滅菌器、電子天平、薄膜過濾器、集菌儀、超凈臺。

1.2 營養瓊脂、改良馬丁氏液體培養基、改良馬丁氏瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、營養肉湯、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基、溴化十六烷三甲胺瓊脂培養基，均由北京陸橋技術有限公司生產。

1.3 稀釋劑：氯化鈉-蛋白胨緩沖液，由北京陸橋技術有限公司生產。

1.4 菌種：大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]由中國藥品生物制品檢定所提供；所有菌種均為第四代。

1.5 樣品：復方米諾地爾酊（批號：100305、100510、100916，100ml/瓶）襄陽市婦幼保健院制劑室。

2 方法與結果

2.1 細菌數、霉菌和酵母菌數測定方法驗證試驗

2.1.1 菌液的制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，35℃培養18～24h，各取1mL，分別加9mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-5～10-7，活菌數約為50～100cfu/mL，做活菌計數備用。

接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁氏液體培養基中，25℃培養18～24h，取1mL，加9mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-5～10-7，活菌數約為50～100cfu/mL，做活菌計數備用。

接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁氏瓊脂斜面培養基中，25℃培養一周，加5mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，洗下霉菌孢子，吸出菌液，用標準比濁管比濁。取1mL，加9mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-4，活菌數約為50～100cfu/mL，做活菌計數備用。

2.1.2 供試液的制備

吸取樣品10mL至有無菌玻璃珠的250mL三角燒瓶中，加90mL無菌的稀釋液，混勻，使成1∶10的供試液。取上述供試液10mL（相當于樣品1g），加入100mL無菌稀釋液中，混勻，過濾，接著用400的稀釋劑沖洗，消除抑菌成分后，取出濾膜，菌面朝上，貼于規定的瓊脂平板上培養。

2.1.3 回收率測定

①試驗組：分別取1∶10的供試液10mL（相當于樣品1g），加入100mL無菌稀釋液中，混勻，過濾，接著用400mL的稀釋劑沖洗，預留100mL稀釋劑各加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌各1mL（50～100cfu/mL），按薄膜過濾法過濾，取出濾膜，菌面朝上，貼于規定的瓊脂平板上，置規定溫度培養24～72h，逐日觀察結果。②菌液組：除不加供試液外，其余操作同試驗組。③供試品對照組：除不加菌懸液外，其余操作同試驗組。④稀釋劑對照組：用稀釋劑取代供試液，其余操作同試驗組。

2.1.4 結果

驗證試驗至少進行三次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。（所得回收率均不低于70%）。

結論：采用薄膜過濾法檢驗復方米諾地爾酊，該試驗對5種菌種的回收率均高于70%，該驗證試驗通過。結果見表1。

表1 菌落計數方法驗證結果（cfu）

2.2 金黃色葡萄球菌檢查方法驗證試驗

2.2.1 試驗組

取1∶10的供試液10mL（相當于樣品1g），加入100mL無菌稀釋液中，混勻，過濾，接著用400mL的稀釋劑沖洗，預留100mL稀釋劑，加入金黃色葡萄球1mL（50～100cfu/mL），按薄膜過濾法過濾，取出濾膜，菌面朝上，貼于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基中35℃培養24h。

2.2.2 陰性菌對照組

取1∶10的供試液10mL（相當于樣品1g），加入100mL無菌稀釋液中，混勻，過濾，接著用400mL的稀釋劑沖洗，預留100mL稀釋劑，加大腸埃希菌1mL（50～100cfu/mL），按薄膜過濾法過濾，取出濾膜，菌面朝上，貼于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基中35℃培養24h。

2.2.3 陽性對照組

除不加供試液外，其余操作同試驗組。

2.2.4 陰性對照組

用稀釋液取代供試液，不加菌液，其余操作同試驗組。

結果：陰性菌對照組未檢出陰性對照菌；試驗組檢出金黃色葡萄球；陽性對照組檢出金黃色葡萄球；陰性對照組無菌生長。結論：根據驗證試驗結果，表明供試品可采用薄膜過濾法檢驗金黃色葡萄球。

2.3 銅綠假單胞菌檢查方法驗證試驗

2.3.1 試驗組

取1∶10的供試液10mL（相當于樣品1g），加入100mL無菌稀釋液中，混勻，過濾，接著用400mL的稀釋劑沖洗，預留100mL稀釋劑，加銅綠假單胞菌1ml（50～100cfu/mL），按薄膜過濾法過濾，取出濾膜，菌面朝上，貼于溴化十六烷三甲胺瓊脂培養基中35℃培養24h。

2.3.2 陰性菌對照組

取1∶10的供試液10mL（相當于樣品1g），加入100mL無菌稀釋液中，混勻，過濾，接著用400mL的稀釋劑沖洗，預留100mL稀釋劑，加大腸埃希菌1mL（50～100cfu/mL），按薄膜過濾法過濾，取出濾膜，菌面朝上，貼于溴化十六烷三甲胺瓊脂培養基中35℃培養24h。

2.3.3 陽性對照組

除不加供試液外，其余操作同試驗組。

2.3.4 陰性對照組

用稀釋液取代供試液，不加菌液，其余操作同試驗組。

結果：陰性菌對照組未檢出陰性對照菌；試驗組檢出銅綠假單胞菌；陽性對照組檢出銅綠假單胞菌；陰性對照組無菌生長。結論：根據驗證試驗結果，表明供試品可采用薄膜過濾法檢驗銅綠假單胞菌。

3 討 論

經過試驗觀察，說明用薄膜過濾法處理過的供試液適合各種試驗菌的生長；供試品對照組無菌生長說明供試品中無影響試驗的雜菌；菌液組各種菌生長良好，說明該方法的實驗環境適合參加試驗的各種菌的生長；陰性對照組無菌生長，說明稀釋劑、培養基及試驗操作過程符合無菌操作的標準。試驗結果表明，采用薄膜過濾法能有效去除復方米諾地爾酊的抑菌成分，對試驗菌的生長無影響，該方法適合復方米諾地爾酊的微生物限度檢查。

[1] 馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊[M].北京:科學出版社,2000:60.

[2] 國家藥典委員會.中國藥典.2005.二部[S].北京:化學工業出版社,2005:附錄XI J.