康寧木霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶與木聚糖酶的研究

鄒水洋 劉傳生 朱丹

(東莞理工學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東東莞 523808)

地球上最大的一類(lèi)可再生有機(jī)資源——木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化與利用是全世界普遍關(guān)注的重大課題。然而，酶使用成本過(guò)高是這一生物技術(shù)遲遲難以產(chǎn)業(yè)化的重要障礙［1］。纖維素酶和木聚糖酶是轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素原料生成可發(fā)酵性還原糖的主要水解酶，提高這兩大類(lèi)酶的生產(chǎn)水平是降低用酶成本的重要途徑，也是該領(lǐng)域主要的研究方向之一。

纖維素酶和木聚糖酶的生產(chǎn)方法有液態(tài)發(fā)酵法和固態(tài)發(fā)酵法，這兩種方法各有優(yōu)劣。一般認(rèn)為，液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件易控制，生產(chǎn)效率高，產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，但投資費(fèi)用及運(yùn)行成本較高［1］。而固態(tài)發(fā)酵由于其特有的經(jīng)濟(jì)、實(shí)用性，近年來(lái)在纖維素酶和木聚糖酶的生產(chǎn)方面已經(jīng)引起了廣泛的重視［1-3］。以前曾對(duì)一株纖維素酶和木聚糖酶的高產(chǎn)菌——康寧木霉QF-02的液態(tài)發(fā)酵工藝開(kāi)展了系列研究，并達(dá)到了較高的產(chǎn)酶水平［4-5］。為進(jìn)一步拓展該菌種的生產(chǎn)應(yīng)用，本文對(duì)其固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，并采用稻草和麩皮這類(lèi)廉價(jià)的原料作為主要的培養(yǎng)基質(zhì)以降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:康寧木霉 (Trichoderma koningii)QF-02由東莞理工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

原料:稻草、麩皮粉碎，75℃烘干，過(guò)20目篩備用。

試劑:Whatman 1#濾紙、木聚糖、水楊素由Sigma公司生產(chǎn) (用于酶活力測(cè)定)，其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。

菌種保藏培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)。

Mandels營(yíng)養(yǎng)液［6］:0.75 g蛋白胨，0.25 g酵母膏，0.3 g脲，1.4 g(NH4)2SO4，2.0 g KH2PO4，0.4 g CaCl2·H2O，0.5 mg FeSO4·7H2O，4.0 mg ZnSO4·7H2O，2.0 mg CoCl2·6H2O，溶于1000 mL蒸餾水中。

種子液培養(yǎng)基:1.0 g葡萄糖溶于100 mL Mandels營(yíng)養(yǎng)液中，于110℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:稻草粉、麩皮按質(zhì)量比 (w/w)3∶2混合，總量5 g，裝于250 mL錐形瓶中，加入pH 5.0的Mandels營(yíng)養(yǎng)液7.5 mL，攪拌均勻，于121℃滅菌20 min。本培養(yǎng)基為發(fā)酵初始培養(yǎng)基，在研究過(guò)程中工藝條件的改變將另行指出。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

種子液制備:菌種在PDA培養(yǎng)基上28.5℃培養(yǎng)7天，長(zhǎng)滿孢子后冷藏備用。從斜面培養(yǎng)基上取孢子一環(huán)接種到種子液培養(yǎng)基，于28.5℃、150 r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)48 h。

固態(tài)發(fā)酵:在固態(tài)培養(yǎng)基中接入種子懸浮液1.0 mL，充分?jǐn)嚢韬笤赟PX-250型生化培養(yǎng)箱28.5℃靜置培養(yǎng)4天。以上實(shí)驗(yàn)均平行做3個(gè)樣品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。

粗酶液的制備:將固態(tài)培養(yǎng)物加入100 mL蒸餾水，在40℃下振蕩 (60 r/min)浸提2 h;然后用棉花過(guò)濾，濾液經(jīng)4000 r/min離心15 min去除孢子，上清液即為粗酶液。

1.3 檢測(cè)方法

濾紙酶活 (FPA)和β-葡萄糖苷酶活的測(cè)定參照 Mandels等人的測(cè)定方法［7］，酶解底物分別為Whatman 1#濾紙和水楊素，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)按DNS法定糖。木聚糖酶活的測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)［8］略加修改:取適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL，加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的木聚糖溶液 (木聚糖溶于pH 4.5的0.1 mol/mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中)，于50℃保溫15 min，以木糖為標(biāo)準(zhǔn)按DNS法定糖。以上酶活測(cè)定中均以底物空白與酶液空白的算術(shù)和作為總空白值處理［9］。酶活力以每分鐘水解底物生成1 μmol還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活力國(guó)際單位 (IU)。固體曲的活力以每克干曲計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 稻草粉和麥麩比例對(duì)產(chǎn)酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶或木聚糖酶的工藝中一般都會(huì)用到一種纖維素原料 (如稻草、蔗渣、麥糟等)與麩皮按一定比例混合作為固態(tài)基質(zhì)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (表1)來(lái)看，稻草粉與麩皮比例為3∶2(w/w)時(shí)，T.koningii QF-02所產(chǎn)生的纖維素酶活和木聚糖酶活均最高。在混合基質(zhì)中，纖維素物質(zhì)可作為碳源和產(chǎn)酶誘導(dǎo)物。而麩皮的作用比較微妙，有人認(rèn)為麩皮含有促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的因子，且能吸收水分保持濕潤(rùn);但麩皮用量過(guò)大使培養(yǎng)基粘性增大、不利于透氣，從而影響霉菌的生長(zhǎng)和酶的分泌［10］。筆者認(rèn)為過(guò)多的麩皮除了上述不利影響外，可能還會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)過(guò)剩而降低酶產(chǎn)量，因?yàn)槔w維素酶和木聚糖酶一般需要在易利用碳源相對(duì)貧乏的狀態(tài)下產(chǎn)生。

T.koningii QF-02在液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶系中，β-葡萄糖苷酶活相對(duì)較低［4-5］，與FPA的比值在1∶3～4，但在本研究中這一比值接近1∶1，表明纖維素酶系組成更趨合理，這可能是固態(tài)發(fā)酵更符合康寧木霉的自然生長(zhǎng)習(xí)性的緣故。但木聚糖酶與FPA的比值與液態(tài)發(fā)酵相比有所下降。

表1 稻草與麩皮比例對(duì)產(chǎn)酶的影響 IU/g

2.2 原料粒度對(duì)產(chǎn)酶的影響

在研究T.koningii QF-02的液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，曾發(fā)現(xiàn)原料粒徑對(duì)產(chǎn)酶也有一定影響，因此本實(shí)驗(yàn)將20目、20～40目、40目粒徑的稻草與麩皮原料配制成培養(yǎng)基，考察不同粒度對(duì)T.koningii QF-02產(chǎn)酶的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (圖1)顯示，原料粒徑在20～40目時(shí)所得酶活最高，20目時(shí)酶活略低，40目時(shí)差距較大。這可能是由于原料過(guò)細(xì)，培養(yǎng)基容易板結(jié)，影響到氧氣和熱量的傳遞，不利于菌體的生長(zhǎng)，從而降低了酶的產(chǎn)量;而原料過(guò)粗使菌種對(duì)原料的利用率降低，同樣會(huì)影響到酶的產(chǎn)量。但采用20～40目的原料會(huì)造成較多細(xì)小顆粒的浪費(fèi)，從節(jié)約原料與提高產(chǎn)量綜合考慮，以下實(shí)驗(yàn)均取用20目的稻草粉和麩皮為原料。

2.3 培養(yǎng)基料液比對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖1 原料粒度對(duì)產(chǎn)酶的影響

Mandels營(yíng)養(yǎng)液包含復(fù)合氮源、礦物質(zhì)及生長(zhǎng)因子，其添加量還決定培養(yǎng)基的潮濕程度。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，水分太少時(shí)，固體培養(yǎng)基外觀干燥、松散，菌體生長(zhǎng)所需的水分及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，代謝減弱，造成酶產(chǎn)量較低;水分過(guò)多時(shí)，培養(yǎng)基聚集呈塊狀，使透氣性下降，有氧呼吸減弱，同化作用受到抑制［11］，酶的產(chǎn)量也降低。當(dāng)料液比為1∶1.5(w/v)時(shí)，培養(yǎng)基全部潤(rùn)濕，結(jié)構(gòu)蓬松分散，菌體對(duì)固體料的利用率較高，酶產(chǎn)量也是各種料液比中最高的 (如表2所示)。以下實(shí)驗(yàn)的料液比均采用1∶1.5。

表2 培養(yǎng)基料液比對(duì)產(chǎn)酶的影響 IU/g

2.4 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

Mandels營(yíng)養(yǎng)液中含較多的KH2PO4，緩沖能力強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)用 H2SO4和 NaOH來(lái)調(diào)節(jié)其pH值分別為:4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5來(lái)考察pH值的改變對(duì)產(chǎn)酶的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。隨著起始pH值的升高，固體發(fā)酵所產(chǎn)生的纖維素酶和木聚糖酶的活力都逐漸升高，在pH 5.5時(shí)酶活最高，隨后下降明顯。T.koningii QF-02在液態(tài)發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酶的最適pH在4.5～5.0［4-5］，在固態(tài)發(fā)酵中最適產(chǎn)酶pH的升高可能與該菌所處的生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生了重大變化有關(guān)。以下實(shí)驗(yàn)的起始pH值均調(diào)節(jié)為5.5。

圖2 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)開(kāi)始后每隔24 h定時(shí)取樣測(cè)定三種酶的活力，直到168 h發(fā)酵過(guò)程結(jié)束。實(shí)驗(yàn)中觀察到培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)基表面就有大量白色菌絲生長(zhǎng)，48 h后發(fā)現(xiàn)有綠色孢子出現(xiàn)，120 h后孢子覆蓋整個(gè)培養(yǎng)基。從酶活測(cè)定結(jié)果 (圖3)來(lái)看:培養(yǎng)時(shí)間在96 h以前，三種酶的活力升高迅速，是主要產(chǎn)酶階段;96 h～120 h增加較少，120 h FPA、β-葡萄糖苷酶活、木聚糖酶活均達(dá)到峰值，分別為13.1 IU/g(干曲)、12.2 IU/g(干曲)、994.7 IU/g(干曲)。此時(shí)，應(yīng)及時(shí)收獲酶，否則酶活力隨即下降。究其原因，一方面是因?yàn)槊傅暮铣苫就Ｖ梗硪环矫嬗捎趦?nèi)源性蛋白酶的水解作用［12］，目標(biāo)酶蛋白會(huì)逐漸變性失活。

3 結(jié)論

菌種T.koningii QF-02在稻草粉與麩皮比為3∶2，粒徑為20目，料水比為1∶1.5，起始pH值5.5，28.5℃培養(yǎng)120 h的優(yōu)化培養(yǎng)條件下達(dá)到了同類(lèi)文獻(xiàn)報(bào)道的較高產(chǎn)酶水平，其FPA、β-葡萄糖苷酶活、木聚糖酶活分別為13.1 IU/g(干曲)、12.2 IU/g(干曲)、994.7 IU/g(干曲)。研究結(jié)果初步表明T.koningii QF-02的固態(tài)發(fā)酵工藝是可行的，且纖維素酶系組成更為合理。至于該菌的固態(tài)發(fā)酵工藝與液態(tài)發(fā)酵工藝的優(yōu)劣評(píng)價(jià)目前還無(wú)法得出明確的結(jié)論，需要從具體的生產(chǎn)條件、生產(chǎn)規(guī)模以及資金與市場(chǎng)因素等多個(gè)方面綜合考慮。

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