葛根異黃酮對衰老模型大鼠學習記憶能力及海馬神經元形態的影響

陳亞奇 王愛梅 田 敏

南陽醫學高等?？茖W校，河南省南陽市 473061

葛根異黃酮是葛根中的主要有效成分，包括葛根素、3－羥基葛根素、3－甲氧基葛根素、葛根素－木糖苷、大豆苷元、大豆苷、芒柄花素、染料木苷、染料木素等。近年來，國內外對葛根提取物——葛根異黃酮的藥理作用進行了較多的研究，發現其具有治療心血管疾病、抗癌作用，治療骨質疏松、預防和治療糖尿病等作用［1～3］。葛根異黃酮對衰老模型大鼠學習記憶及海馬神經元形態的影響少見報道，本實驗欲探討葛根異黃酮對衰老模型大鼠學習記憶能力及對海馬神經元形態的影響，進而探討葛根異黃酮的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物。選用健康雌性 Wistar大鼠55只，3～4月齡，體重（180±20）g，由河南醫學動物實驗中心提供（許可證號：410117）。

1.1.2 實驗藥物試劑及儀器。D－半乳糖由上海試劑二廠提供（批號20050422）；葛根異黃酮由南陽張仲景現代中藥發展有限責任公司提供，批號20080722；烏拉坦由上海國藥集團化學試劑有限公司提供，批號T20080319；Morris水迷宮由北京微信斯達科技發展有限公司研制。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥。選用3～4月齡，雌性Wistar大鼠，體重（180±20）g，隨機分為對照組，衰老模型組（簡稱模型組），藥物低、中、高劑量組，每組11只。造模時，模型組、藥物組每天頸背部皮下注射1%D－半乳糖100mg／kg，生理鹽水組（對照組）每天頸背部皮下注射等量生理鹽水，連續6周。造模后開始灌胃給藥，藥物低、中、高劑量組每天分別給予40mg／kg、80mg／kg、160mg／kg 葛 根 異 黃 酮 灌胃，模型組、生理鹽水組每天給予80mg／kg生理鹽水灌胃，連續8周。

1.2.2 大鼠學習記憶能力測定－Morris水迷宮實驗。動物灌胃結束后進行Morris水迷宮實驗（MWM）。（1）定位航行實驗：測量大鼠對水迷宮學習和記憶的獲取能力。將平臺置于西南象限，從池壁四個象限的中點將大鼠面向池壁放入水池，以120s為時限記錄大鼠找到平臺時間，即逃避潛伏期（escaping latency period，EL）4次訓練將大鼠分別從不同象限放入水中，至120s找不到平臺，即將其引上平臺，EL記為120s，間隔為60s，讓大鼠在平臺上休息。取實驗第4、5天EL，計算其均數。（2）空間探索實驗：用于測量大鼠對平臺空間位置記憶的保持能力。定位航行實驗完撤除平臺，記錄120s內大鼠在平臺象限的游泳距離占總距離的百分比。

1.2.3 海馬組織學觀察。最后一次行為學測試完成后，將大鼠斷頭處死，在冰凍手術臺上迅速取腦，分離兩側的大腦半球，取出海馬組織用4%甲醛進行固定，石蠟切片，蘇木素伊紅染色，光學顯微鏡觀察。

1.3 數據處理 使用SPSS16.0軟件包進行數據處理分析，數據用均數±標準差（）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 運動軌跡 大鼠尋找平臺的方式稱為搜索策略，其游泳軌跡主要分為四種：邊緣式（找不到目標平臺，學習記憶能力很差），隨機式（無目的尋找，雖然到達平臺，但學習記憶能力較差），趨向式（有目的尋找平臺，學習記憶能力較好），直線式（直接游向平臺，學習記憶能力很好）。在訓練開始時各組動物都主要以邊緣式和隨機式策略尋找平臺，隨著訓練次數的增加，這兩種搜索策略的出現率逐漸下降，而另外兩種策略即趨向式和直線式的出現率逐漸增加。綜合5d的訓練情況發現，生理鹽水組（對照組）、高劑量組搜索策略以直線式為主；中、低劑量組以趨向式為主；而模型組以隨機式、邊緣式為主。大鼠尋找平臺的路線，見圖1。

圖1 大鼠尋找平臺的路線圖

2.2 各組大鼠學習記憶能力比較 隨著訓練的進行，各實驗組EL均不斷縮短，與模型組相比中、高劑量組EL明顯縮短（P＜0.01）；各實驗組撤離平臺后大鼠在原平臺象限內游泳的距離占整個游泳距離的百分比顯示：與模型組相比，中、高劑量組所占距離百分比明顯增高（P＜0.05，P＜0.01），這說明葛根異黃酮中、高劑量對大鼠空間方位記憶能力有一定的影響。而低劑量組雖然要高些，但差異無顯著性（P＞0.05），詳見表1。

2.3 光鏡下海馬CA1區組織病理學改變 HE顯示染色顯示見圖2。

表1 各組大鼠學習記憶能力比較（）

表1 各組大鼠學習記憶能力比較（）

注：與模型組比較：＊P＜0.05，#P＜0.01。

組別 n 逃避潛伏期（s） 所占距離百分比（%）對照組 9 20.78±3.12# 44.54±2.29#模型組 9 42.24±5.41 33.94±1.69低劑量組 9 25.50±3.66＊ 38.55±3.70中劑量組 10 23.80±1.49# 41.61±2.56＊高劑量組 10 21.82±2.74# 43.65±1.56#

圖2 光鏡下海馬CA1區組織學改變

對照組海馬CA1區有3～4層錐體細胞，細胞呈圓形或橢圓形，排列整齊緊密，染色均一、結構完整，細胞核圓而大，核內容物清晰；模型組錐體細胞層次明顯減少，細胞排列紊亂，細胞脫失明顯，細胞核體積明顯減少，結構不清楚，胞膜核膜界限不清晰；低劑量組海馬CA1區結構欠完整，錐體細胞排列不整齊，細胞有脫失；中劑量組CA1區結構較完整，錐體細胞排列較整齊，細胞脫失現象較少；高劑量組CA1區有近3～4層錐體細胞，排列較整齊，尚緊密，細胞體積與生理鹽水組（對照組）相比無明顯差別，細胞呈圓形，核內容物清晰。

3 討論

在MWM水迷宮實驗中，大鼠學會尋找固定位置的隱蔽平臺，形成穩定的空間位置認知，這種空間認知是加工空間信息（外部線索）形成的。平臺的位置與大鼠自身所處的位置和狀態無關，是一種以異我為參照點的參考認知，所形成的記憶是一種空間參考記憶。從信息的加工和提取方式來看，這種空間參考記憶進入意識系統，其儲存的機制主要涉及邊緣系統（如海馬）以及大腦皮層有關腦區，常伴有Hebb突觸修飾，屬于陳述性記憶。

本實驗水迷宮結果顯示：造模后，模型組的EL明顯延長，平臺所在象限的距離百分比明顯降低；用藥后，藥物組EL縮短，平臺所在象限的距離百分比明顯增高，這說明葛根異黃酮可以提高衰老模型大鼠的學習記憶能力。海馬結構屬大腦邊緣系統，位于顳葉內側面的基底部。海馬細胞結構分為分子層、錐體細胞層和多形細胞層；在冠狀位上海馬分為CA1、CA2、CA3和CA4區。CA1區含有小錐體細胞，CA2區含有大量的軸突，CA3區含有苔蘚狀纖維，CA4區含有大錐體細胞［4］。

海馬是學習記憶的關鍵部位，如果海馬內有過量的自由基堆積，就會對其造成損傷，加速神經元細胞的凋亡［5］，使其數目減少，從而造成學習記憶功能減退。有實驗證明，大鼠學習記憶能力的優劣，在一定程度上和海馬自由基損傷程度有關。研究證實，老年人學習記憶功能減退與其海馬組織的重量減輕，腦內神經元數目減少及神經元突觸的可所塑變化有關［6］。本實驗中筆者對造模后海馬結構研究顯示：海馬輪廓模糊，神經元細胞數目減少，細胞間界限不清。用藥后，上述指標明顯改善。說明葛根異黃酮對損害神經元具有保護作用，這也可能是其改善學習記憶功能機制之一。

［1］ 郭建平，宮明利，陳啟蒙，等.葛根黃酮滴丸對離體豚鼠心臟冠脈血流量的影響〔J〕.藥物研究，2008，17（5）：5－6.

［2］ 徐芾，金邦荃，武衛平，等.植物異黃酮對更年期婦女骨密度和骨代謝血清生化指標的影響〔J〕.中國婦幼保健，2007，22：1517－1519.

［3］ 曾明，張漢明，鄭水慶，等.葛根提取物對糖尿病大鼠血糖和血流動力學的影響〔J〕.解放軍藥學學報，2004，20（4）：293－294.

［4］ 羅煥敏.海馬結構－從形態、功能到可塑性、衰老性變化〔J〕.神經解剖學雜志，1996，12（2）：177－184.

［5］ 邱南，席先成，朱振鐸，等.益智合劑改善學習記憶和抗衰老作用的動物實驗 〔J〕.實用醫藥雜志，2004，21（10）：921－923.

［6］ 溫二生，王鳳珍，胡志蘋.海馬與學習記憶的研究進展〔J〕.贛南醫學院學報，2006，26（4）：651－652.