人CCL21基因克隆及其序列分析

劉長王瑩 崔 凱 李 勝*

（1 臨沂大學(xué)商學(xué)院，山東 臨沂 276000；2 山東省腫瘤防治研究院，山東 濟南 250117）

次級淋巴組織趨化因子（secondary lymphoid tissue chemokine，SLC）屬于CC亞族趨化因子，即CCL21，是由Nagria[1]在人基因表達序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）數(shù)據(jù)庫中克隆出的趨化因子，CCL21的基因定位于9p13，其cDNA序列包括847個堿基，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，其分子量約為14KD，由134個氨基酸殘基組成，其中23個氨基酸殘基為信號肽序列，111個氨基酸的成熟肽含有4個半胱氨酸殘基，與其他人類CC型趨化因子有21%～33%的同源性，但有其獨特的約30個氨基酸組成的羧基末端延伸，該延伸內(nèi)包含2個半胱氨酸殘基。CCL21主要存在于外周次級淋巴組織，如脾、淋巴結(jié)等部位，它具有較強的趨化作用，特別是對樹突狀細胞，T細胞與自然殺傷細胞，能使其聚集到外周淋巴組織或器官，而外周淋巴組織是免疫應(yīng)答發(fā)生的初始部位。Campebell等[2]研究證實：在流動狀態(tài)下CCL21能誘導(dǎo)循環(huán)T細胞快速粘附到高內(nèi)皮小靜脈（high endothelial venules，HEV）上，參與淋巴細胞和樹突狀細胞（dendritic cell，DCs）的歸巢和遷移。CCR7是CCL21的高親合力受體，CCL21具有種屬特異性，人CCL21只與CCR7相結(jié)合，而小鼠CCL21不僅與CCR7也與CXCR3結(jié)合[3]。為進一步探索CCL21在腫瘤基因治療中的應(yīng)用，本實驗中我們成功克隆了人CCL21基因并進行了序列分析。

1 材料與方法

1.1 淋巴結(jié)組織及質(zhì)粒、菌種

胃癌患者手術(shù)清掃下來的新鮮淋巴結(jié)組織取自山東大學(xué)附屬齊魯醫(yī)院，經(jīng)患者家屬同意后收集進行實驗；pEASY-T1 simple cloning kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Trans109化學(xué)感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

YJ-1450D 型醫(yī)用凈化工作臺；ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer全自動DNA測序儀；TGL-18R高速低溫離心機；PB303-電子精密天平；ABI 9700 PCR儀；WH-1微型漩渦混合儀；移液器2μl、10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl；-20℃低溫冰箱；DYY-皿型電泳裝置等。

1.3 主要試劑

Trizol試劑購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、XbaⅠ、NotⅠ內(nèi)切酶購于大連寶生物工程有限公司（TAKARA產(chǎn)品）；T4 DNA連接酶、DNA marker、質(zhì)粒DNA小提試劑盒購于北京天根生物技術(shù)公司；膠回收試劑盒均系MBI fermenters公司產(chǎn)品；酵母提取物、蛋白胨和瓊脂糖均購于英國OXOID公司。

1.4 引物設(shè)計及合成

CCL21引物設(shè)計：應(yīng)用primer 5.0軟件設(shè)計引物，由上海生物工程有限公司合成。

上游引物：5’-GCtctagaatggctcagtcactggctct-3’；下游引物：5’-ATATgcggccgcctatggccctttaggggtctgt-3’。

1.5 總RNA的提取及濃度測定

取新鮮淋巴結(jié)組織約100mg，采用Trizol法提取總RNA，以隨機六聚體為引物合成cDNA，以此cDNA為模板，以P1、P2為引物，先94℃預(yù)變性5min，再以94℃ 45s，48℃ 45s，72℃ 1min 進行35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。以此次PCR產(chǎn)物為模板，以P1、P2為引物，先94℃預(yù)變性5min，再以94℃ 45s，58℃ 45s，72℃1min進行30個循環(huán)，最后72℃延伸7min。1%的瓊脂糖凝膠電泳分離分析PCR產(chǎn)物，用膠回收試劑盒純化回收擴增的目的基因。

1.6 基因克隆及測序

將純化回收PCR片段與克隆載體pEASY-T1按摩爾數(shù)5∶1加入連接反應(yīng)體系內(nèi)，室溫連接4h后轉(zhuǎn)化Trans109感受態(tài)，37℃培養(yǎng)過夜，挑取菌落PCR陽性的單個菌落于LB+Amp的培養(yǎng)液37℃振蕩培養(yǎng)過夜，小量提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)XbaⅠ、NotⅠ雙酶切初步鑒定后，由本室采用ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer全自動DNA測序儀完成測序。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 人CCL21基因克隆

從淋巴結(jié)組織中提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模板及上下游引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增片段約425bp，與目的基因大小相符（圖1）。

圖1 人CCL21基因的PCR擴增

（附：CCL21基因序列：GCTCTAGAATGGCTCAGTCACTGGC TCTGAGCCTCCTTATCTTGGTTCTGGCCTTTGGCATCCCCAGGAC CCAAGGCAGTGATGGAGGGGCTCAGGACTGTTGCCTCAAGTAC AGCCAAAGGAAGATTCCCGCCAAGGTTGTCCGCAGCTACCGGA AGCAGGAACCAAGCTTAGGCTGCTCCATCCCAGCTATCCTGTTC TTGCCCCGCAAGCGCTCTCAGGCAGAGCTATGTGCAGACCCAAA GGAGCTCTGGGTGCAGCAGCTGATGCAGCATCTGGACAAGACAC CATCCCCACAGAAACCAGCCCAGGGCTGCAGGAAGGACAGGGG GGCCTCCAAGACTGGCAAGAAAGGAAAGGGCTCCAAAGGCTGC AAGAGGACTGAGCGGTCACAGACCCCTAAAGGGCCATAGGCGG CCGCATAT）

2.2 瓊脂糖電泳雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒pEASY-T1-CCL21用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ與NotⅠ雙酶切，鑒定插入目的片段。由于所選用的pEASY-T1 simple cloning vector是不帶任何酶切位點的克隆載體，所以不管目的片段插入方向如何，雙酶切后只得到一種結(jié)果，一條位于約425bp條帶，一條位于約3900bp處（圖2）。

圖2 質(zhì)粒pEASY-T1-CCL21的酶切鑒定

2.3 重組質(zhì)粒的序列分析

將酶切鑒定陽性含目的基因的菌液保存，并送于上海博尚生物技術(shù)有限公司進行序列分析（圖3），結(jié)果顯示獲得的目的基因序列與基因庫中CCL21基因序列一致，說明成功克隆出CCL21基因片段。

3 討 論

圖3 pEASY-T1 simple-CCL21質(zhì)粒構(gòu)建后測序結(jié)果

本研究采用的是基因克隆技術(shù)，基因克隆（gene cloning）是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一項具有革命性的研究技術(shù)，可概括為：分、切、連、轉(zhuǎn)、選。“分”是指分離制備合格的待操作的DNA，包括作為運載體的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特異的限制性內(nèi)切酶切開載體DNA，或者切出目的基因；“連”是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來，形成重組的DNA分子；“轉(zhuǎn)”是指通過特殊的方法將重組的DNA分子送入宿主細胞中進行復(fù)制和擴增；“選”則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個體。基因工程技術(shù)的兩個最基本的特點是分子水平上的操作和細胞水平上的表達，而分子水平上的操作即是體外重組的過程，實際上是利用工具酶對DNA分子進行“外科手術(shù)”。Berg等[4]于1972年把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，從此產(chǎn)生了基因克隆技術(shù)。一般來說，基因克隆技術(shù)包括把來自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。因此基因克隆技術(shù)又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組DNA技術(shù)以及基因工程等。本實驗選用T-Vector法基因克隆，因Taq DNA酶擴增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，而pEASY-T1 simple cloning Vector末端游離的T堿基與其互補形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。

許多研究表明，CCL21/CCR7軸在多種腫瘤的播散和器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[5-12]。CCL21通過趨化T細胞、DC、NK細胞，介導(dǎo)T細胞、NK細胞依賴的抗腫瘤免疫應(yīng)答，分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-12等細胞因子，改善腫瘤微環(huán)境，促進全身的細胞免疫應(yīng)答，抵抗腫瘤細胞分泌的免疫抑制因子導(dǎo)致的免疫逃避，促進血管抑制性因子的分泌來抑制血管生成以及誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡等來發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。但CCL21/CCR7相互作用具有雙向效應(yīng)，可促進腫瘤細胞分泌蛋白水解酶，加快腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤進一步發(fā)展；因此，深入探析CCL21/CCR7與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用機制，阻斷其不利效應(yīng)，為CCL21成為腫瘤生物治療和免疫治療新靶點提供全面保障。

綜上所述，利用PCR技術(shù)獲得目的基因片段CCL21，將其插入pEASY-T1 simple cloning vector，行酶切鑒定及目的基因序列分析，所獲得的人CCL21基因序列與GenBank報道的人CCL21序列一致。我們成功克隆了人CCL21基因，為下一步實驗研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]Nigira M,Imai T,Hieshima K,et al.Molecular cloning of a novel human CC chemokine secondary lymphoid-tissue chemokine that is a potent chemo-attractant for lymphocytes and mapped to chromosome 9p13[J].J Biol Chem,1997,272(31):19518-19524.

[2]Campbell JJ,Hedrick J,Zlotnik A,et al.Chemokines and the arrest of lymphocytes rolling under fl ow conditions[J].Science,1998,279(5349):381-384.

[3]Soto H,Wang W,Strieter R,et al.The CC chemokine 6Ckine binds the CXC chemokine receptor CXCR3[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(14):8205-8210.

[4]Morrow JF,Berg P.Cleavage of Simian virus 40 DNA at a unique site by a bacterial restriction enzyme[J].Proc Natl Acad Sci U S A.1972,69(11):3365-3369.

[5]Muller A,Homey B,Soto H,et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J].Nature,2001,410(6824):50-56.

[6]Mashino K,Sadanaqa N,Yamaquchi H,et al.Expression of chemokine receptor CCR7 is associated with lymph node metastasis of gastric carcinoma[J].Cancer Res,2002,62(10):2937-2941.

[7]Nakata B,Fukunaga S,Noda E,et al.Chemokine receptor CCR7 expression correlates with lymph node metastasis in pancreatic cancer[J].Oncology,2008,74(1/2):69-75.

[8]Mumtaz M,W?gs?ter D,L?fgren S,et al.Decreased expression of the hemokine CCL21 in human colorectal adenocarcinomas[J].Oncol Rep,2009,21(1):153-158.

[9]Sancho M,Vieira JM,Casalou C,et al.Expression and function of the chemokine receptor CCR7 in thyroid carcinomas[J].J Endocri nol,2006,191(1):229-238.

[10]Yousefieh N,Hahto SM,Stephens AL,et al.Regulated Expression of CCL21 in the Prostate Tumor Microenvironment Inhibits Tumor Growth and Metastasis in an Orthotopic Model of Prostate Cancer[J].Cancer Microenviron,2009,2(1):59-67.

[11]Takeuchi H,FujimotoA,Tanaka M,et al.CCL21 chemokine regulates chemokine receptor CCR7 bearing malignant melanoma cells[J].Clin Cancer Res,2004,10(7):2351-2358.

[12]Shields JD,Kourtis IC,Tomei AA,et al.Induction of lymphoidlike stroma and immune escape by tumors that express the chemokine CCL21[J].Science,2010,328(5979):749-52.