電針改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及其與海馬神經(jīng)細(xì)胞谷氨酸、NMDAR表達(dá)的關(guān)系

韋登明 賈學(xué)敏 尹向旭 蔣雯雯 (寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，浙江 寧波 315211)

針刺治療具有明顯改善血管性癡呆(VD)患者的癥狀和體征、增強(qiáng)其學(xué)習(xí)記憶能力的作用〔1〕，但具體的分子生物學(xué)機(jī)制還不十分清楚。已有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)是突觸可塑性〔2〕，后者的理想模型是高頻刺激引起的長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(LTP)，而谷氨酸激活N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)是誘導(dǎo)LTP產(chǎn)生的前提條件〔3〕。我們以往的研究表明〔4〕，電針大鼠百會(huì)、大椎穴能改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與促進(jìn)海馬LTP和增強(qiáng)海馬突觸可塑性有關(guān)。但電針改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力與海馬谷氨酸及其NMDA受體表達(dá)的關(guān)系如何?尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠VD模型基礎(chǔ)上，通過檢測分析電針干預(yù)VD大鼠時(shí)對海馬谷氨酸及其NMDA受體表達(dá)變化影響，旨在探討電針對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶影響的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SD大鼠40只，購于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號0102008。雌、雄不限，體重200～250 g，自由飲食。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組、電針組，每組10只。

1.2 試劑儀器 G6805電針儀(上海華誼儀器制造廠生產(chǎn));Morris水迷宮(北京新天地科技公司生產(chǎn));兔抗大鼠谷氨酸、NMDA受體多克隆抗體、生物素化羊抗兔 IgG、SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);RY-2000瑞醫(yī)病理圖文分析系統(tǒng)(東南大學(xué)瑞醫(yī)科技產(chǎn)品)。

1.3 模型制備 模型組、電針組采用王蕊等〔5〕推薦的方法造模，將大鼠用10%的水合氯醛(3 ml/kg體重)麻醉后，仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈;腹腔注射硝普鈉(3.5 mg/kg體重)后，隨即用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，夾閉10 min再通10 min，再夾閉10 min，再通后縫合傷口，放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過程同上，但不阻斷頸總動(dòng)脈及注射硝普鈉。

1.4 電針干預(yù)方法 電針組大鼠術(shù)后第7天，手術(shù)切口基本愈合，飲食正常，開始給予電針治療。參照實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)〔6〕中大鼠的穴位定位方法取百會(huì)、大椎穴進(jìn)針，用28號30 mm長毫針，于大鼠頭部百會(huì)穴(頂骨正中)斜刺1.5 mm，大椎穴(第7頸椎與第1胸椎間，背部正中)直刺1.5 mm，連接電針儀，采用連續(xù)波，頻率為50 Hz，強(qiáng)度以大鼠能耐受為度(約1 mA)，每天電針1次，留針20 min，連續(xù)治療10 d。

1.5 檢測方法

1.5.1 學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)檢測 采用Morris水迷宮試驗(yàn)，于電針治療結(jié)束時(shí)(即實(shí)驗(yàn)第17天)進(jìn)行檢測。①定位航行試驗(yàn):歷時(shí)6 d，每天2次，將大鼠固定從第一象限面向池壁放入水中，記錄其2 min內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期(escape latency，EL)。逃避潛伏期越短提示大鼠學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)，反之則越差。②空間探索試驗(yàn):定位航行試驗(yàn)結(jié)束后(即實(shí)驗(yàn)第22天)撤除平臺(tái)，將大鼠固定從第一象限放入水中，測其2 min內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)及其在水迷宮外環(huán)停留時(shí)間。大鼠在相同時(shí)間內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)越多，學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)，反之則越差。由配套電腦系統(tǒng)自動(dòng)記錄成績。

1.5.2 腦組織Glu、NMDA受體免疫組織化學(xué)染色觀察 電針治療結(jié)束后，用10%水合氯醛(3 ml/kg體重)麻醉大鼠，迅速開胸暴露心臟;經(jīng)升主動(dòng)脈插管后，先用100 ml生理鹽水快速?zèng)_洗，隨后用4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH7.4)灌注約1 h;灌注完畢后取海馬腦組織，用甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋切片后行谷氨酸、NMDA受體免疫組織化學(xué)染色。

免疫組織化學(xué)染色主要步驟為:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滴加0.3%H2O2在37℃下處理15 min;滴加10%正常羊血清在37℃下處理10 min，勿洗;滴加兔抗大鼠谷氨酸、NMDA受體多克隆抗體(1∶300、1∶400)在4℃下處理24 h;滴加生物素化羊抗兔IgG二抗(1∶100)在37℃下處理2 h;滴加SABC適量，在37℃下處理1 h;DAB顯色5～10 min;陰性對照實(shí)驗(yàn)用磷酸鹽緩沖液代替一抗，其余步驟相同。每步之間用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)洗3次，每次5 min。常規(guī)脫水、透明、封片。結(jié)果判斷:顯微鏡下海馬神經(jīng)細(xì)胞胞漿呈棕色著色者為陽性細(xì)胞，用RY-2000瑞醫(yī)病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算其積分光密度。

2 結(jié)果

2.1 電針對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響 正常對照組、假手術(shù)組、電針組大鼠6 d平均逃避潛伏期明顯短于模型組(P＜0.01)，而正常對照組、假手術(shù)組和電針組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。正常對照組、假手術(shù)組、電針組大鼠在平臺(tái)象限跨越次數(shù)明顯多于模型組(P＜0.01)，而電針組、正常對照組、假手術(shù)組3組之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明未給予治療的模型大鼠學(xué)習(xí)記憶獲取能力較差，而電針治療則可改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。見表1。

2.2 電針對大鼠腦組織谷氨酸、NMDA受體表達(dá)的影響 正常對照組、假手術(shù)組大鼠海馬組織見少量谷氨酸、NMDA受體陽性細(xì)胞;模型組大鼠腦組織見很少谷氨酸、NMDA受體免疫染色陽性細(xì)胞，主要分布海馬神經(jīng)細(xì)胞胞漿;應(yīng)用電針治療后，大鼠腦組織谷氨酸、NMDA受體免疫染色陽性細(xì)胞積分光密度值較模型組明顯增加，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

表1 大鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)檢測結(jié)果(±s，n=10)

表1 大鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)檢測結(jié)果(±s，n=10)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01

組別 逃避潛伏期(s) 平臺(tái)跨越次數(shù)(次)正常對照組33±4.96 7.13±1.06假手術(shù)組 34±5.65 6.95±1.18模型組 78±6.421) 1.52±1.371)電針組 41±4.362) 5.68±1.642)

表2 電針對大鼠腦海馬組織谷氨酸、NMDA受體表達(dá)的影響(±s，n=10)

表2 電針對大鼠腦海馬組織谷氨酸、NMDA受體表達(dá)的影響(±s，n=10)

與假手術(shù)組組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

受體積分光密度正常對照組組別 谷氨酸積分光密度 NMDA 61.2±3.4 47.4±2.9假手術(shù)組 56.4±4.2 45.3±3.6模型組 37.3±4.11) 28.2±3.91)電針組 52.7±4.72) 41.5±4.52)

3 討論

VD常由缺血性腦血管疾病引起。腦缺血易導(dǎo)致海馬發(fā)生損傷，海馬是學(xué)習(xí)和記憶的中樞，因此，VD表現(xiàn)為高級神經(jīng)認(rèn)知功能障礙為主的一組臨床綜合征。針刺治療血管性癡呆具有多通道、多靶點(diǎn)、多水平的調(diào)節(jié)和控制作用，電針作為一種傳統(tǒng)的非藥物治療手段，多年來在我國得到廣泛應(yīng)用，而且在臨床老年性癡呆治療中有肯定的價(jià)值〔1，7～10〕。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，VD病變在腦，督脈通于腦，百會(huì)、大椎皆屬督脈，百會(huì)為“三陽五會(huì)”，大椎為“諸陽之會(huì)”，針刺兩穴，可醒腦益智開竅、振奮陽氣，并達(dá)陽以生陰之功，可促進(jìn)VD大鼠腦組織功能恢復(fù)〔8〕，故本實(shí)驗(yàn)選穴以督脈之百會(huì)、大椎為治療穴。結(jié)果提示電針百會(huì)、大椎穴可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，約50%的谷氨酸參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的突觸傳遞，幾乎可調(diào)節(jié)正常腦內(nèi)的所有功能，包括學(xué)習(xí)、記憶、運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知和發(fā)育。海馬結(jié)構(gòu)是學(xué)習(xí)記憶的重要區(qū)域，其神經(jīng)元后膜有NMDAR，是興奮性氨基酸谷氨酸的一類特異性受體。谷氨酸受體可分為代謝型和離子型兩大類，離子型受體NMDAR被認(rèn)為是突觸可塑性及皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元LTP的主要調(diào)控者，構(gòu)成了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要功能如學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)。有研究證明:選擇性敲除小鼠海馬CA 1區(qū)錐體細(xì)胞的NR 1亞單位后，其NMDAR誘導(dǎo)的LTP被破壞，且小鼠表現(xiàn)為空間記憶障礙〔11〕。

本研究提示學(xué)習(xí)記憶能力下降可能與谷氨酸、NMDA受體表達(dá)減少致神經(jīng)傳遞功能障礙有關(guān)。關(guān)于VD大鼠海馬神經(jīng)谷氨酸、NMDA受體表達(dá)減少，我們推測可能與下列因素有關(guān):在急性腦缺血缺氧等病理情況下，海馬結(jié)構(gòu)等缺血易損區(qū)的谷氨酸大量釋放，激活了NMDAR，導(dǎo)致由NMDAR介導(dǎo)的Ca2+大量內(nèi)流，Ca2+超載引發(fā)一系列的毒性反應(yīng)，造成神經(jīng)元損傷、脫失〔12〕，由于急性腦缺血時(shí)谷氨酸的過度釋放和耗竭，使其與NMDA受體的結(jié)合減少或NMDA受體失活;同時(shí)由于海馬神經(jīng)元的數(shù)目減少和結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致NMDA受體數(shù)目減少。由于LTP的產(chǎn)生有賴于谷氨酸與其NMDA受體的結(jié)合〔3〕，海馬神經(jīng)谷氨酸、NMDA受體表達(dá)減少，必然造成LTP損害，引起神經(jīng)傳導(dǎo)功能障礙。電針治療后，電針組大鼠與模型組比較，谷氨酸、NMDA受體免疫陽性細(xì)胞積分光密度值顯著增大，提示電針大鼠百會(huì)、大椎穴可提高海馬神經(jīng)谷氨酸、NMDA受體的表達(dá)。

我們已有的研究表明〔4〕;電針VD大鼠百會(huì)、大椎穴可提高海馬神經(jīng)突觸密度，促進(jìn)突觸結(jié)構(gòu)的可塑性;并可促進(jìn)海馬神經(jīng)LTP，加快海馬神經(jīng)元突觸傳遞過程。因此，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為電針改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制可能由于提高了海馬神經(jīng)突觸密度，增加了海馬神經(jīng)突觸的谷氨酸、NMDA受體表達(dá)的數(shù)量，從而促進(jìn)促進(jìn)海馬LTP來實(shí)現(xiàn)的。具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

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