銀杏葉提取物EGb761對銅與高膽固醇共處理家兔主動脈病變的影響

張瑞峰 馬東明 姜希娟 盧 斌 蘇金玲 郭茂娟 (天津中醫藥大學病理教研室，天津 30093)

Sparks等〔1〕在研究高膽固醇血癥與阿爾茨海默病(AD)發病的關系時發現，以添加微量銅離子的蒸餾水代替自來水后，給予高膽固醇飲食的家兔，AD的形態和病理表現更突出。高脂血癥尤其是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量的升高，已經成為公認的致動脈粥樣硬化(AS)的危險因素。我們在研究中發現銅與高脂飼養的家兔主動脈存在明顯的動脈粥樣硬化病變，銀杏葉提取物EGb761對這一病變具有一定的保護作用。銀杏葉提取物EGb761是按德國Schwabe專利工藝利用醇溶液從銀杏科植物銀杏葉中提取的有效成分，主要含有24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內酯，后者含5種銀杏內酯(ginkolides A、B、C、M、J)和白果內酯。近年來研究發現銀杏葉提取物具有一定的降脂作用。本研究將對銀杏葉提取物EGb761對銅和高膽固醇引起的動脈粥樣硬化的作用及其機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 銀杏葉提取物EGB761(商品名:金納多)，德國威瑪舒培博士藥廠，批號:9840808;膽固醇，分析純，天津市英博生化試劑有限公司，批號:090423;血清總膽固醇(TC)測定試劑盒，批號:090801;總甘油三酯(TG)測定試劑盒，批號:093071;高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒，批號:090806;LDL-C測定試劑盒，批號:090080;均由中生北控生物科技股份有限公司提供。丙二醛(MDA)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，批號:20090730;Trizol?Reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA)試劑盒、Oligod(T)16，High capacity cDNA Re-verse Transcription Kit試 劑 盒 (Applied Biosystems、P/N:4368814)，Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(Applied Biosystems、P/N:4367659)、PCR引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)。

1.2 主要儀器 722分光光度計，Image-Proplus圖像分析系統，HYBAIDPE480反轉錄儀，ABI7300實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)儀等。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物模型的建立與分組 健康成年雄性新西蘭大白兔(軍事醫學科學院實驗動物中心提供)27只，體質量(2 356±212)g，在溫度(28±2)℃，濕度37% ～48%，12 h交替照明的清潔環境中給予普通飼料和自來水適應喂養2 w后，隨機取出9只作為對照組，采用普通飼料和蒸餾水喂養，直至實驗結束，共9 w。其余家兔參照D.Larry Sparks等〔1〕的方法:給予2%高膽固醇飼料和含0.12×10－6銅離子(以硫酸銅的形式)的蒸餾水造模。6 w后，造模家兔死亡1只，將造模成功家兔隨機分為模型組(由于停用膽固醇后，家兔血清膽固醇水平會很快降低，因此，6 w后繼續給予高膽固醇飼養3 w，作為模型組，n=9)和 EGB761 組(EGB761 50 mg·kg－1·d－1灌胃 3 w，其余處理同模型組，n=8)。上述給藥劑量為“按照成人體表面積折算的等效劑量”。

1.3.2 標本獲取與處理 實驗結束時禁食12 h，耳緣靜脈取血，分離血清，于－20℃下保存備用。戊巴比妥鈉(25 mg/kg)靜脈麻醉后，迅速分離自心臟到髂動脈分叉處之間的主動脈，將動脈周圍的脂肪組織剔除干凈，縱向剖開，生理鹽水洗凈后蘇丹Ⅲ染色，數碼相機照相，采用Image-Proplus圖像分析系統測量斑塊面積占主動脈總面積的百分比。并于主動脈弓處取直徑3 mm的組織作HE染色。于肝臟相同位置取約100 mg組織塊，液氮保存備用。

1.3.3 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和MDA水平測定 采用酶比色法測定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，硫代巴比妥酸(TBA)法測定血清MDA水平，具體操作依試劑盒說明進行。

1.3.4 RT-PCR法測定肝LDLR和LRP1 mRNA表達 用Trizol試劑盒抽提肝組織總RNA，采用紫外分光光度計定量并檢測RNA純度。按逆轉錄試劑盒要求將總RNA逆轉錄成cDNA。特異性引物序列，GAPDH，F:5'-TCTCTCAAgATTgTCAg-CAACg-3'，R:5'-CTTCACAAAgTggTCATTgAgg-3';LDLR，F:5'-CAAgCCCAgggCCATCgTggTg-3'，R:5'-CACTgAAgATggCTTCgTT-gATg-3';LRP1，F:5'-gCCAgAAgATCgACggCACC-3'，R:5'-TAgACgCTgCCACTgCggTA-3'。反應參數為95℃預變性10 min，95℃變性10 s→60℃延伸1 min，共40個循環。擴增完畢后，運行融解曲線以驗證PCR過程中單一擴增產物形成。所有目的基因(target)mRNA含量用比較域值的方法通過相對每個樣品的看家基因GAPDH 計算。目的基因量=2－ΔΔCT，ΔΔCT是目的基因和看家基因的循環域值的差值。數據通過對照組進行標化。ΔΔCT=(CTtarget-CTGAPDH)實驗組 －(CTtarget-CTGAPDH)對照組。

2 結果

2.1 主動脈病理形態病變 大體標本肉眼觀察發現，正常組家兔主動脈壁光滑未見粥樣硬化斑塊;模型組家兔可見其脂質斑塊從升主動脈、主動脈弓處向下延伸，呈不規則片狀分布，突出于內膜表面，蘇丹Ⅲ染色動脈粥樣硬化病變處顯示紅色;EGB761組主動脈壁斑塊形成的程度較低，僅在升主動脈或主動脈弓處可見少量散在分布的脂質斑塊。與正常組相比，模型組和EGB761組斑塊面積顯著增加，差異有統計學意義(P＜0.05);與模型組相比，EGB761組斑塊面積明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。HE染色顯示，正常組血管內膜光滑、連續、內皮完整;模型組家兔主動脈內膜明顯增厚，大量脂質斑塊形成，脂質斑塊肩部可見炎細胞浸潤，脂質斑塊內可見泡沫細胞聚集，細胞壞死，并有中膜平滑肌萎縮;EGB761組病變與模型組相似，但程度較輕。

2.2 血脂水平改變 與正常組相比，模型組和EGB761組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均顯著升高，差別具有統計學意義(P＜0.05)。與模型組相比，EGB761組LDL-C水平顯著下降，差別具有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

2.3 肝組織LDLR和LRP1 mRNA表達 與正常組相比，模型組和EGB761組肝臟LDLR mRNA表達水平均顯著下降，差異有統計學意義(P＜0.05)。EGB761組肝臟LRP1 mRNA表達，與模型組和正常組相比，均顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

2.4 血清MDA水平改變 與正常組相比，模型組和EGB761組血清MDA水平均顯著升高，差別具有統計學意義(P＜0.05)。與模型組相比，EGB761組MDA水平顯著下降，差別具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 EGB761對家兔主動脈斑塊面積和血清MDA水平的影響(±s)

表1 EGB761對家兔主動脈斑塊面積和血清MDA水平的影響(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 n MDA(nmol/ml) 斑塊面積/主動脈面積(%)正常組 9 2.82±1.171)0模型組 9 39.12±18.082) 54.72±18.11)EGB761組 8 17.98±18.551)2) 32.80±11.411)2)

表2 EGB761對家兔血脂的影響(±s，mg/dl)

表2 EGB761對家兔血脂的影響(±s，mg/dl)

TC TG LDL-C HDL-C組別(n)正常組(9) 50.28±10.822) 66.67±31.862) 0.27±0.132)1.09±0.222)模型組(9)1 390.34±314.721)848.72±226.361)14.37±2.381)5.38±0.431)EGB761組(8)1 512.22±254.161) 737.18±194.351) 8.05±1.411)2) 4.98±0.611)

表3 EGB761對家兔肝臟LDLR和LRP1 mRNA表達的影響(±s)

表3 EGB761對家兔肝臟LDLR和LRP1 mRNA表達的影響(±s)

0.38±0.25模型組 9 0.10±0.021) 0.20±0.10 EGB761組 8 0.10±0.041) 0.68±0.171)2)LDLR LRP1正常組 9 0.60±0.122)組別 n

3 討論

研究結果顯示，銀杏葉提取物EGB761能顯著減少主動脈粥樣硬化面積，具有延緩動脈粥樣硬化病變進展的作用，與豐飛等的研究結果一致〔2〕。EGB761對動脈粥樣硬化的保護作用，可能與其降低血脂的作用有關。EGB761的降脂作用近年來已被越來越多的實驗研究證實。潘洪平等〔3〕發現銀杏葉片能顯著降低血瘀證模型大鼠的 TG和 LDL-C水平，對 TC、HDL-C無顯著作用。豐飛等〔2〕研究發現銀杏葉提取物對TC、TG、LDL-C、ox-LDL均有顯著的降低作用。張琪等〔4〕研究發現銀杏葉提取物能顯著降低已形成高脂血癥大鼠血漿中的TC、LDL-C，顯著升高HDL-C。雖然銀杏葉提取物對血清 TC、TG、HDL-C的作用研究結果不一致，但各項研究均顯示銀杏葉提取物具有降低升高的血清LDL-C的作用。本實驗研究結果也證實EGB761具有降低高脂血癥家兔血清LDL-C水平的作用。

LDL-C的清除主要在肝臟進行，LDL-C與肝細胞膜上的LDLR結合，在LRP的協助下進入肝細胞被降解清除。研究結果顯示EGB761能在轉錄水平上顯著升高LRP1。EGB761降低LDL-C的作用可能是通過促進LRP的表達加速其清除作用實現的。MDA是細胞膜脂質過氧化的終產物之一，氧化損傷引起MDA生成量的增加，而MDA又可進一步激發細胞多方面的損傷，MDA的量常?？煞从硻C體內的脂質過氧化程度。研究結果顯示EGB761能顯著降低高脂血癥家兔血清MDA水平，與吳小明〔5〕的研究結果一致。苗軍等〔6〕的研究結果也顯示，銀杏提取物具有降低血清及肝組織過氧化脂質的作用。

因此，銀杏葉提取物EGB761具有抑制動脈粥樣硬化形成的作用。其作用機制可能是通過降低LDL-C水平，抑制脂質過氧化實現的。

1 Sparks DL，Schreurs BG.Trace amounts of copper in water induce betaamyloid plaques and learning deficits in a rabbit model of Alzheimer's disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2003;100(19):11065-9.

2 豐 飛，金偉東，吳 翔.銀杏葉提取物對動脈粥樣硬化大鼠斑塊及血脂水平影響〔J〕.亞太傳統醫藥，2009;5(10):10-3.

3 潘洪平，危華玲，楊嘉珍.復方銀杏葉片對血淤證模型高血脂的影響〔J〕.中國醫院藥學雜志，2009;29(11):865-7.

4 張 琪，馬 博，朱玲玲，等.銀杏葉提取物對實驗性高脂血癥大鼠的調脂機制〔J〕.華西藥學雜志，2007;22(6):605-8.

5 吳小明.銀杏葉提取物對實驗性高脂血癥及脂質過氧化作用的影響〔J〕.安徽醫藥，2009;13(5):498-9.

6 苗 軍，張馨木，孫 波，等.銀杏葉提取物對實驗性高脂血癥血脂代謝的影響及抗氧化作用〔J〕.中國老年學雜志，2006;26(11):1544-5.