纈沙坦對老齡高血壓大鼠腎臟重構及MMP-9、c-fos表達的影響

朱竹先 張子強 苗 華 許冬梅 (山東大學附屬山東省千佛山醫院腎內科，山東 濟南 25004)

高血壓導致最直接的損害是靶器官結構功能的損害，是引起各種并發癥的病理基礎。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)在高血壓形成、發展及靶器官重構過程中發揮重要作用。血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑(ARB)阻斷RAAS的受體環節。本研究通過應用ARB評價其對老年高血壓大鼠RAAS系統及腎臟基質金屬蛋白酶(MMP-9)、c-fos表達的影響，為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 40周齡自發性高血壓大鼠(SHR)20只(上海第二醫科大學實驗動物中心提供)，清潔級，體重200～250 g，雌雄各半。正常飼養。隨機分組(n=10):SHR-C(空白對照組)、SHR-B+L(貝那普利+纈沙坦組)以及老齡Wistar京都大鼠(WKY)對照組。SHR-L 組:纈沙坦 15 mg·kg－1·d－1;SHR-C組和老齡WKY大鼠組均同樣給予等量生理鹽水。各組大鼠經胃管給藥，干預12 w。

1.2 藥品及試劑 纈沙坦，杭州默沙東制藥有限公司提供。膠原Ⅳ一抗，即用型SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物公司。MMP-9、c-fos引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標本留置 10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，取腎臟組織，－70℃保存待檢測。

1.3.2 免疫組化 應用SABC試劑盒，按照試劑盒說明進行，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片觀察。

1.3.3 大鼠腎臟MMP-9、c-fos mRNA檢測 取－70℃保存的大鼠腎臟組織，采用Trizol(Invitrogen，USA)勻漿，氯仿-異丙醇法抽提總RNA。

1.3.4 RT-PCR 取總 RNA 1 μg，進行逆轉錄(RT)反應(TAKARA)，RT產物-20℃保存。PCR引物:β-actin，上游:5'-AAGATCCTGACCGAGCGTGGC-3'，下 游:5'-cagcactgtgttggcatagagg-3'。MMP-9引物:上游:5'-TTTGACAGCGACAAGAAGTGG-3'，下游:5'-AGGGCGAGGACCATAGAGG-3'。c-fos引物:上游:5'-ACCAGTCCGGACCTGCAGTGG-3'，下游:5'-GCGGCATTTGGCTGCAGCCAT-3'。以上引物均為上海生工合成。cDNA的合成和實時熒光定量PCR檢測采用SYBR Ex Script RT-PCR Kit(TAKARA)，同時設不加模板cDNA的陰性對照。應用Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀進行擴增，95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，循環40次。擴增完成后從60℃開始升溫作熔解曲線驗證擴增產物的特異性。

1.3.5 Western印跡雜交 取腎臟組織中加入濕重組織體積的3～5倍體積的組織裂解液提取總蛋白，取10 μg蛋白提取液用考馬斯亮藍法進行定量，調節蛋白濃度，取40 μl蛋白經SDS-PAGE電泳轉移至PVDF膜上，封閉后加入稀釋后的一抗、二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔單克隆IgG)，進行抗原抗體反應。用DAB溶液檢測雜交信號，結果用Gel Doc2000凝膠成像系統測定各條帶積分灰度值，所得結果為扣除背景的積分光密度(OD)，以β-actin作為內參，計算相對值。

1.4 統計學分析 所有數據采用SPSS10.0統計軟件進行分析，測定數據以±s表示，采用t檢驗及單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況 干預12 w后，SHR對照組的大鼠死亡1只，SHR藥物治療組與SHR對照組比較，收縮壓(SBP)明顯降低，有顯著差異性，但仍高于WKY對照組;三組心率無顯著性差異。見表1。

2.2 免疫組化結果 干預12 w后與WKY對照組大鼠腎臟膠原Ⅳ免疫組化表達(n=10，5.12±1.11)比較，SHR對照組腎臟組織膠原Ⅳ含量明顯增高(n=9，13.21±3.5，P＜0.01)，藥物干預組能顯著降低膠原Ⅳ表達(n=10，6.66±1.06，P＜0.01)。見圖1。

表1 干預12 w后各組大鼠收縮壓、心率比較(±s)

表1 干預12 w后各組大鼠收縮壓、心率比較(±s)

與WKY對照組比較:1)P＜0.01，與SHR對照組比較:2)P＜0.01

組別 n 收縮壓(mmHg) 心率(次/min)WKY對照組10 130.00±31.33 378.37±39.00 SHR對照組 9 222.66±21.581) 391.22±29.11干預組 10 160.60±18.292)369.53±30.00

圖1 各組腎臟膠原Ⅳ免疫組化表達(DAB，×200)

圖2 各組MMP-9、c-fos mRNA表達

2.3 實時熒光定量RT-PCR結果 SHR對照組MMP-9、c-fos mRNA表達明顯高于WKY對照組(P＜0.01)，藥物干預組能顯著降低MMP-9、c-fos mRNA表達水平(P＜0.01)。見圖2。

2.4 Western印跡結果 SHR組MMP-9、c-fos蛋白表達顯著高于WKY對照組(P＜0.01)，藥物干預組均能夠降低MMP-9、c-fos蛋白表達水平(P＜0.01)。見圖3。

圖3 各組MMP-9、c-fos蛋白表達

3 討論

腎臟對高血壓引起的血流動力學刺激發生適應性代償反應，可以導致病理性腎臟重構。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)在高血壓器官重構的發病機制中發揮了重要作用〔1〕。ARB阻斷RAAS的受體水平，理論上能夠有效阻斷AngⅡ對AT1受體的作用，發揮心血管保護作用。此外，ARB可以有效改善單純應用ACEI所導致的組織醛固酮逃逸現象〔2〕。本實驗中，與WKY對照組比較，藥物干預組SBP明顯下降。SHR對照組血漿AngⅡ明顯增高，藥物干預組AngⅡ明顯降低。提示ARB能夠有效抑制RAAS系統。

本實驗中，與WKY對照組比較，SHR對照組及藥物干預組腎臟組織Ⅳ型膠原表達明顯增高，藥物干預組能夠降低膠原表達提示:Ⅳ型膠原增生在高血壓腎臟中發揮重要作用，而阻斷RAAS系統能有效降低其表達。

基質金屬蛋白酶(MMPs)能夠特異地降解細胞外基質，在器官組織重構中起重要的作用。有研究顯示，在高血壓腎臟病中的的MMP-9表達和活性增高〔3，4〕。這說明MMP-9在腎臟重構過程對細胞外基質的合成、分解產生重要的影響。此外，研究同樣發現，c-fos在在高血壓腎臟病腎臟重構過程也發揮重要作用〔5〕。本研究通過對老齡高血壓大鼠研究發現，SHR腎臟中MMP-9的表達較同齡WKY明顯增多，在SHR，RAAS過度激活，以及c-fos等生長因子促進腎臟Ⅳ型膠原等細胞外基質的合成，但MMP-9的過表達說明，MMP-9增強部分腎臟Ⅳ型膠原等細胞外基質的分解代謝，均提示MMP-9在腎臟重構過程中發揮作用。此外，與WKY對照組比較，SHR各組c-fos明顯增高，提示AngⅡ結合AT1受體，通過信號轉導系統進一步促進與基因轉錄調控相關的c-fos等因子的表達，促進細胞的增生和肥大。本實驗結果:老齡SHR組MMP-9及c-fos mRNA和蛋白表達明顯高于WKY對照組，藥物干預組能夠顯著降低其表達水平，此外，藥物干預組顯著降低腎臟Ⅳ型膠原的表達水平，說明ARB類藥物能夠阻斷RAAS系統部分通過抑制MMP-9及c-fos途徑改善腎臟重構，發揮保護性作用。

綜上，本研究結果進一步提示，應用ARB可以有效保護靶器官，預防和逆轉器官重構。

1 孫寧玲，王鴻懿，陳源源，等.ERK表達及活化在自發性高血壓大鼠心肌肥厚中作用的研究〔J〕.高血壓雜志，2002;10(3):352-5.

2 李淑梅.血管緊張素轉換酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體1拮抗劑對組織醛固酮逃逸現象的實驗研究〔J〕.中華心血管病雜志，2001;29(5):549-52.

3 Nicoletti A，Heudes D，Hinglais N，et al.Lelf ventricular fibrosis in renovascular hypertensive rats〔J〕.Hypertension，1995;26(1):101-11.

4 苗 偉，高 楓，龔少愚，等.原發性高血壓患者血清基質金屬蛋白酶9與升主動脈彈性的關系〔J〕.中華高血壓雜志，2010;4(3):385-9.

5 院紅梅，潘敬遠.雙腎雙夾腎性高血壓大鼠左心室原癌基因c-fos表達的變化〔J〕.廣州醫學院學報，2002;30(1):62-3.