河北地區人群基質金屬蛋白酶-2基因多態性與冠心病的相關性

王俊杰 劉 彬 韓 一 蘇 明 鄭 斌 (河北醫科大學基礎生物化學教研室，河北 石家莊 050017)

基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)是基質金屬蛋白酶家族(MMPs)中一種重要的鋅離子水解酶，能夠降解作為動脈粥樣斑塊基底膜和纖維帽重要組成部分的Ⅳ型膠原，促進中膜平滑肌細胞向內膜下遷移〔1，2〕，加速動脈粥樣硬化進程，并導致不穩定性斑塊的形成〔3，4〕。研究發現MMP-2基因啟動子區域-1306位點存在C/T置換現象〔5〕，可能引起其組織表達水平不同，從而影響動脈粥樣硬化的病程，這種堿基序列的不同提示人群中存在遺傳性冠心病事件的易感性。本研究采用病例對照方法，擬探討MMP-2啟動子區單核苷酸多態性(SNPs)與冠心病發病風險及冠脈病變程度的關系，進一步闡明冠心病的發病機制。

1 對象與方法

1.1 對象 均來自河北地區無血緣關系人群。冠心病組:共89例，男70例，女19例，年齡42～71〔平均(58.1±9.7)〕歲，來自河北醫科大學第二醫院、河北省人民醫院、滄州市人民醫院，均符合WHO冠心病診斷標準;同時行冠狀動脈造影，以左冠狀動脈主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動脈至少有1支狹窄≥50%為陽性，累及左主干時以同時累及左前降支和左回旋支計算。非冠心病患者(對照組):共97例，男48例，女49例，年齡25～60〔平均(42.4±14.3)〕歲，均為健康體檢者。

1.2 方法

1.2.1 標本收集與制備 冠心病組在冠狀動脈造影前采集空腹血標本，對照組在清晨空腹采靜脈血。標本置于含有0.2 ml的2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，－70℃保存，待提取基因組DNA。

1.2.2 模板DNA的提取 依照北京博大泰克生物公司聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒操作步驟進行。

1.2.3 主要試劑 Taq DNA聚合酶(5 U/μl)，dNTP(10 mmol/L);引物均由上海生工生物工程公司提供，上游為5'actgactctggaaagtcagagca 3'，下游為 5'ctgagacctgaagagctaaagaggt 3'。PCR 反應體系為 60 μl，其中包括:去離子水33.3 μl，10 × 緩沖液 6 μl，MgCl2(25 mmol/L)6 μl，dNTP 1.2 μl，上、下游引物混合物(10 μmol/L)6 μl，Taq DNA 聚合酶 1.5 μl，模板 DNA 6 μl。PCR反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，60℃復性45 s，72℃延伸 45 s，30 個循環;最后 72℃延伸10 min。

1.2.4 1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物 取PCR擴增產物5 μl，按5∶1(V/V)與6×上樣緩沖液混合后，上樣于1% 瓊脂糖凝膠板負極端(含0.05 μg/ml EB)，1×乙酸電泳緩沖液(TAE)中120 V電壓電泳20 min，電泳完畢后紫外燈下觀察。與DNA Marker比對，可觀察到長度為408 bp的擴增片段。

1.2.5 測序 將電泳正確的PCR產物送交上海生工生物工程公司進行測序，比對測序結果，見圖1。

1.3 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件。運用哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)遺傳平衡定律檢驗樣本的群體代表性。兩組人群中基因型及等位基因頻率分布的比較采用計數資料的χ2檢驗進行分析。

圖1 PCR產物測序

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 冠心病組與對照組經檢驗均為遺傳平衡群體，表明研究對象的選擇無群體遺傳學偏差。見表1。

表1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

2.2 EMP-2基因型和等位基因頻率在兩組中的分布情況 冠心病組與對照組相比，基因型頻率與等位基因頻率的差異均無統計學意義，提示MMP-2基因啟動子區-1306位點C/T多態性與冠心病無相關性。見表2。

表2 MMP-2基因型的分布及等位基因頻率〔n(%)〕

2.3 MMP-2基因型對冠狀動脈病變程度的影響 見表3。冠心病患者基因型分布與冠脈狹窄累及支數無關(P＞0.05)。

表3 MMP-2基因型對冠狀動脈病變的影響(n)

3 討論

冠心病中冠狀動脈粥樣斑塊的形成和發展過程與細胞外基質(ECM)重構的過程有密切聯系。其中，MMP-2的作用十分重要。研究表明血清MMP-2水平與急性冠脈綜合征、冠狀動脈病變程度具有相關性〔6〕，動物實驗發現MMP-2基因缺失可抑制平滑肌細胞從中膜到內膜的遷移及內膜增生〔7〕，Jenkins等〔8〕發現在球囊損傷后鼠頸動脈內膜細胞中MMP-2的激活與血管平滑肌細胞的遷移一起進行，在接受PTCA的患者中也存在相似的情況。由于MMP-2啟動子區-1306C/T的變異會影響其表達水平，與動脈粥樣硬化的發生和發展有關〔9〕，因此本研究選擇此位點觀察其與冠心病的遺傳易感性及冠狀動脈病變程度的關系。

本研究發現，MMP-2啟動子區-1306位點CC/CT基因型與冠心病的遺傳易感性不存在相關性，與冠狀動脈病變程度亦無關系，可能此位點突變與否不影響該蛋白的表達水平?？紤]在冠心病的發生過程中，多種遺傳與環境因素相互作用最終對疾病的發生起決定作用。在以后的研究中，對各種影響因素應綜合考慮，從而對冠心病的預防起到指導性的效果。

1 Foda HD，George S，Rollo E，et al.Regulation of gelatinases in human airway smooth muscle cells:mechanism of progelatinase A activation〔J〕.Am J Physiol，1999;277(1-1):174-82.

2 Uzui H，Lee JD，Shimizu H，et al.The role of protein-tyrosine phosphorylation and gelatinase production in the migration and proliferation of smooth muscle cells〔J〕.Atherosclerosis，2000;149(1):51-9.

3 Rekhter MD.Collagen synthesis in atherosclerosis:too much and not enough〔J〕.Cardiovasc Res，1999;41(2):376-84.

4 Newby AC，Zaltsman AB.Molecular mechanisms in intimal hyperplasia〔J〕.J Pathol，2000;190(3):300-9.

5 Dong C，Wang Q，Ma ZW，et al.MMP-2，MMP-9 and TIMP-2 gene polymorphisms in Chinese patients with generalized aggressive periodontitis〔J〕.J Clin Periodontol，2007;34(5):384-9.

6 陳樣新，傅國勝，徐 耕，等.急性冠狀動脈綜合癥患者血清基質金屬蛋白酶2的變化〔J〕.中國動脈硬化雜志，2005;13(3):363-6.

7 Kuzuya M，Kanda S，Sasaki T，et al.Deficiency of gelatinase a suppresses smooth muscle cell invasion and development of experimental intimal hyperplasia〔J〕.Circulation，2003;108(11):1375-81.

8 Jekins GM，Crow MT，Bilato C，et al.Increased expression of membranetype matrix metalloproteinase and preferential localization of matrix metalloproteinase-2 to the neointima of balloon-injured rat carotid arteries〔J〕.Circulation，1998;97(1):82-90.

9 黃為民，劉 豐，鐘志敏.急性冠狀動脈綜合征患者血清基質金屬蛋白酶-2的水平變化及其意義〔J〕.中國危重癥急救醫學，2006;18(4):242-3.