腎上腺髓質(zhì)素對(duì)內(nèi)毒素性休克大鼠心肌細(xì)胞β－腎上腺素受體激動(dòng)劑反應(yīng)性的影響*

張曉暉， 金滿文

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣州 深圳 518033;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，湖北 武漢 430030)

在內(nèi)毒素血癥中，細(xì)菌或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)啟動(dòng)一系列的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，導(dǎo)致心臟收縮效能的降低、左心室功能不全［1］，其機(jī)制目前尚不清楚。腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，ADM)是一種多功能的調(diào)節(jié)肽［2］，在多種不同的病理生理?xiàng)l件下，特別是內(nèi)毒素性休克時(shí)，其循環(huán)血液中的水平顯著提高［3］。另外在心臟組織中已檢測(cè)到ADM mRNA的表達(dá)、ADM免疫活性及其豐富的結(jié)合部位，ADM已被看成是調(diào)節(jié)心臟功能的自分泌或旁分泌因子［4］。我們用高劑量ADM長(zhǎng)時(shí)間孵育正常心室肌細(xì)胞來模擬內(nèi)毒素血癥時(shí)的過度產(chǎn)生，并以細(xì)胞縮短為指標(biāo)，研究?jī)?nèi)毒素癥休克對(duì)心肌收縮的影響及ADM在其中的作用。

β－腎上腺素受體信號(hào)系統(tǒng)是介導(dǎo)心肌收縮的主要通路之一。該系統(tǒng)主要包括β－腎上腺素受體、G－蛋白、腺苷酸環(huán)化酶(adenyl cyclase，AC)、蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)和收縮結(jié)構(gòu)的組成元素。內(nèi)毒素性休克時(shí)，循環(huán)血液中增加的ADM可減少人心肌細(xì)胞縮短速率，并鈍化β－腎上腺素受體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞縮短速率的增加［5］。此外，心肌細(xì)胞對(duì)β－腎上腺素受體刺激的正性變力反應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)cAMP的增加相關(guān)聯(lián)。因此，我們以細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平為指標(biāo)，探討ADM對(duì)內(nèi)毒素性休克大鼠β－腎上腺素受體信號(hào)系統(tǒng)的影響。

材料和方法

1 動(dòng)物和試劑

健康雄性SD大鼠，10－15周齡，體重250－300 g，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。人ADM和ADM－(22－52)購于 Peninsula Laboratories。LPS(Escherichia coli serotype 0111∶B4)、牛血清白蛋白、XIV型蛋白酶、異丙腎上腺素(isoprenaline，Iso)、forskolin(FKN)、3－異丁基 －1－甲基黃嘌呤(3－isobutyl－1－methylxanthine，IBMX)和其它化學(xué)試劑購于Sigma－Aldrich。Ⅱ型膠原酶為Worthington產(chǎn)品。

2 內(nèi)毒素性休克動(dòng)物模型

參照文獻(xiàn)［6］方法，大鼠腹腔內(nèi)注射LPS(10mg/kg，ip)誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥。LPS處理4 h后，出現(xiàn)豎毛、淡漠、腹瀉等內(nèi)毒素血癥體征的清醒大鼠被用于實(shí)驗(yàn)。大約10%動(dòng)物不出現(xiàn)上述體征，即LPS抵抗的大鼠，則從實(shí)驗(yàn)中剔除。正常對(duì)照組動(dòng)物注射生理鹽水(1 mL/kg，ip)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中不再用LPS處理心肌細(xì)胞。

3 細(xì)胞分離程序

單個(gè)心室肌細(xì)胞參照文獻(xiàn)［6］所述的酶解法分離。斷頸處死動(dòng)物，迅速開胸，取出心臟并固定于Langendorff裝置上。使用37℃氧飽和的蒂羅德液灌流心臟冠脈系統(tǒng)5 min后，再用無鈣蒂羅德液灌流5 min，然后用含有1.75 g/L II型膠原酶，1 g/L小牛血清白蛋白和0.28 g/L XIV型蛋白酶的無鈣蒂羅德液灌流20－30 min。取下變軟的心臟，輕輕吹打，使心肌細(xì)胞懸浮于高K+溶液(mmol/L):10 KCl，120谷氨酸鉀，10 KH2PO4，1.8 MgSO4，10 牛磺酸，10 HEPES，0.5 EGTA，20葡萄糖，10甘露醇，用KOH調(diào)pH值至7.3。實(shí)驗(yàn)前將分離的心肌細(xì)胞于室溫下放置至少1 h。

4 測(cè)定心肌細(xì)胞收縮

心室肌細(xì)胞收縮指標(biāo)通過一個(gè)視頻邊緣檢測(cè)系統(tǒng)(Ion-Optix)測(cè)定，在60 Hz頻率下對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)度進(jìn)行采樣。簡(jiǎn)單地說，就是將細(xì)胞放置于浴槽，后者固定于倒置顯微鏡(Nikon)下。用鉑電極以20%閾上刺激、0.2 Hz的頻率對(duì)細(xì)胞進(jìn)行場(chǎng)刺激(Model S88，Grass)。心肌細(xì)胞經(jīng)顯微鏡附帶的照相系統(tǒng)(IonOptix MyoCam)顯示于計(jì)算機(jī)的顯示屏上。SoftEdge Acquisition軟件(IonOptix)捕捉并將細(xì)胞長(zhǎng)度轉(zhuǎn)化成為數(shù)字信號(hào)。IonWizard分析軟件 (IonOptix)分析這些數(shù)字信號(hào)以獲得細(xì)胞收縮的指標(biāo)。最大細(xì)胞縮短程度用靜息細(xì)胞長(zhǎng)度的百分比表示。實(shí)驗(yàn)在室溫(22－24℃)下進(jìn)行。

5 細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的測(cè)量

上述分離的心肌細(xì)胞懸浮于20 mL臺(tái)式液。調(diào)整心肌細(xì)胞數(shù)至6×107/L緩沖液，并置于聚丙乙烯管。在顯微鏡下觀察，細(xì)胞懸液中呈桿狀的心肌細(xì)胞，即有活力的心肌細(xì)胞占60% －70%。心肌細(xì)胞預(yù)先用100 μmol/L IBMX在37℃孵育15 min，防止cAMP降解。加入100 nmol/L ADM－(22－52)孵育30 min。然后分別加入1 μmol/L Iso處理細(xì)胞3 min或1 μmol/L FKN處理細(xì)胞5 min。

4℃離心收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，棄上清。加0.05 mol/L HCl，并放置于沸水中煮3 min。冷卻并冷凍干燥，凍存于－80℃冰箱備用。按cAMP試劑盒(cyclic AMP EIA kit，Bio－medical Technologies)說明，用ELISA的方法測(cè)量心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP含量。在分光光度計(jì)(ImmunoReader NJ2001，Japan Inter Med)410 nm處讀取吸光度值。每孔測(cè)量3次。Bradford技術(shù)(Bio－Rad protein assay)進(jìn)行樣本蛋白定量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用nmol/g蛋白表示。

6 實(shí)驗(yàn)分組

(1)對(duì)照(control)組:正常心肌細(xì)胞;(2)LPS處理組:自內(nèi)毒素休克大鼠分離得到的休克心肌細(xì)胞;(3)LPS+ADM－(22－52)組:用100 nmol/L ADM－(22－52)處理休克心肌細(xì)胞30 min;(4)control+ADM 60 min組:用100 nmol/L ADM孵育正常心肌細(xì)胞60 min;(5)control+ADM 60 min+ADM－(22－52)30 min組:用100 nmol/L ADM孵育正常心肌細(xì)胞60 min，后用100 nmol/L ADM－(22－52)處理心肌細(xì)胞30 min。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 內(nèi)毒素休克對(duì)大鼠心肌細(xì)胞收縮的影響

圖1顯示內(nèi)毒素休克大鼠模型的心肌細(xì)胞縮短程度較正常對(duì)照組心肌細(xì)胞明顯減弱(P＜0.01)。100 nmol/L ADM－(22－52)與休克心肌細(xì)胞孵育30 min，細(xì)胞縮短程度可完全恢復(fù)，與休克心肌細(xì)胞比，顯著差異(P＜0.01)，與正常對(duì)照細(xì)胞比較，無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 1.The effects of LPS and ADM on rat myocardial cell shortening ＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs LPS group.圖1 LPS及ADM對(duì)大鼠心肌細(xì)胞縮短的影響

2 ADM對(duì)正常大鼠心肌細(xì)胞收縮的影響

如圖2所示，100 nmol/L ADM與正常心肌細(xì)胞孵育時(shí)間超過60 min時(shí)，細(xì)胞縮短程度比正常細(xì)胞明顯減弱(P＜0.01)。100 nmol/L ADM－(22－52)繼續(xù)孵育心肌細(xì)胞30 min，細(xì)胞縮短程度可完全恢復(fù)。

3 腎上腺髓質(zhì)素對(duì)內(nèi)毒素休克大鼠心肌細(xì)胞β－腎上腺素受體激動(dòng)劑反應(yīng)性的影響

如圖3所示，內(nèi)毒素休克心肌細(xì)胞 cAMP基礎(chǔ)水平［(10.95±3.20)nmol/g protein，n=8］較正常心肌細(xì)胞［(15.74 ±3.32)nmol/g protein，n=7，P ＜0.05］降低。休克細(xì)胞經(jīng)100 nmol/L ADM－(22－52)孵育30 min后，其基礎(chǔ)水平cAMP恢復(fù)至正常水平(n=6，P＞0.05)。

經(jīng)磷酸二酯酶抑制劑IBMX處理后，正常心肌細(xì)胞、內(nèi)毒素休克心肌細(xì)胞和ADM－(22－52)處理的休克心肌細(xì)胞的cAMP水平與前面結(jié)果相似，提示 IBMX處理對(duì)基礎(chǔ)水平cAMP影響不大。

如圖3顯示，1 μmol/L Iso誘導(dǎo)正常心肌細(xì)胞cAMP增加至(56.40±7.74)nmol/g protein(n=7);誘導(dǎo)休克心肌細(xì)胞cAMP增加至(40.35±5.23)nmol/g protein(n=8)，明顯較正常心肌細(xì)胞減弱(P＜0.01);ADM－(22－52)處理的休克心肌細(xì)胞cAMP水平增加至(52.45±9.23)nmol/g protein(n=6)，與相應(yīng)休克心肌細(xì)胞比較差異顯著(P＜0.05);與相應(yīng)正常心肌細(xì)胞比較無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 2.The effect of ADM treatment for 60 min on rat myocardial cell shortening.*P＜0.05 vs control group.圖2 ADM孵育60 min對(duì)正常大鼠心肌細(xì)胞縮短的影響

Figure 3.The effect of ADM on β － adrenergic responsiveness in cardio myocytes of septic shock rats..*P＜0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs corresponding control group;#P＜0.05，##P ＜0.01 vs corresponding LPS group.圖3 ADM對(duì)內(nèi)毒素性休克大鼠心肌細(xì)胞β－腎上腺素受體激動(dòng)劑反應(yīng)性的影響

1 μmol/L FKN誘導(dǎo)正常心肌細(xì)胞cAMP增加至(95.29±7.06)nmol/g protein(n=8)，使休克心肌細(xì)胞cAMP增加至(87.29±8.00)nmol/g protein(n=6)，使ADM－(22－52)處理的休克心肌細(xì)胞cAMP水平則增加至(91.22±8.55)nmol/g protein(n=6)，3組之間無顯著差異(P＞0.05)。

討 論

本研究觀察到，休克心肌細(xì)胞縮短程度較正常心肌細(xì)胞明顯減弱，提示內(nèi)毒素體克影響了心肌細(xì)胞的收縮功能，這與以前小鼠、家兔和豚鼠的研究結(jié)果一致［7－9］。

特異性的ADM受體拮抗ADM－(22－52)可使減弱的休克心肌細(xì)胞收縮恢復(fù)正常，提示ADM在內(nèi)毒素性休克心功能不全中具有重要作用。由于ADM在內(nèi)毒素性休克中大量產(chǎn)生，我們用高劑量的ADM孵育正常心肌細(xì)胞，若正常心肌細(xì)胞與ADM孵育時(shí)間超過60 min，則表現(xiàn)出明顯的負(fù)性肌力作用;特異性的ADM受體拮抗ADM－(22－52)可取消以上負(fù)性肌力作用。這說明ADM可直接抑制心肌細(xì)胞收縮。有學(xué)者在家兔心室肌細(xì)胞上也觀察到了ADM的負(fù)性變力作用，它還同時(shí)減小［Ca2+］i和L型鈣電流，并發(fā)現(xiàn)這些作用部分經(jīng)由左旋精氨酸－NO途徑介導(dǎo)［10］。

β－腎上腺素受體信號(hào)系統(tǒng)是介導(dǎo)心肌收縮的主要通路之一。在研究中，與正常對(duì)照組比較，用Iso刺激內(nèi)毒素性休克大鼠的β－腎上腺素受體，cAMP的增加明顯減少。Forskolin(一種直接的AC激動(dòng)劑)增加cAMP的作用在兩組間沒有變化。以上結(jié)果說明內(nèi)毒素性休克大鼠心肌細(xì)胞對(duì)β－腎上腺素受體刺激反應(yīng)性的缺陷存在于AC水平之前，有可能在β－腎上腺素受體與AC之間，或是出現(xiàn)β－腎上腺素受體下調(diào)，內(nèi)毒素性休克并不影響AC的水平或功能。這與早前的研究結(jié)果類似。Risφe等［11］發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素性休克大鼠心臟7型AC的mRNA表達(dá)減少，而4型AC的mRNA表達(dá)是增加的，另外兩種5型和7型AC的mRNA表達(dá)在對(duì)照和模型組之間沒有差異，因而總體mRNA水平不變。Matsuda等［12］發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素性休克的家兔β－腎上腺素受體密度與正常組比較沒有變化，而 Gsα蛋白和GsαmRNA的表達(dá)卻減少了50%。

本研究發(fā)現(xiàn)特異性的ADM受體拮抗劑ADM－(22－52)可恢復(fù)內(nèi)毒素性休克時(shí)心肌細(xì)胞對(duì)β－腎上腺素受體激動(dòng)劑的反應(yīng)性降低，說明內(nèi)毒素性休克時(shí)過量產(chǎn)生的ADM使大鼠心肌細(xì)胞收縮減弱，有可能是因?yàn)锳DM使大鼠心肌細(xì)胞對(duì)β－腎上腺素受體刺激的反應(yīng)性降低。人心臟衰竭的特征之一是對(duì)β－腎上腺素受體刺激的變力反應(yīng)性減弱，這種變化通常都?xì)w因于β－腎上腺素受體下調(diào)［13］和(或)G蛋白的改變［14］。近來的研究提示NO產(chǎn)生增加可能是引起衰竭心臟β－腎上腺素受體低反應(yīng)性的另一機(jī)制［15］。ADM可刺激多種細(xì)胞NO產(chǎn)生增加或iNOS表達(dá)增加［16］。ADM是否通過后二者的增加影響內(nèi)毒素性休克大鼠β－腎上腺素能受體信號(hào)系統(tǒng)的反應(yīng)性還有待進(jìn)一步研究。

［1］Lancel S，Joulin O，F(xiàn)avory R，et al.Ventricular myocyte caspases are directly responsible for endotoxin－induced cardiac dysfunction［J］.Circulation，2005，111(20):2596－2604.

［2］Hinson JP，Kapas S，Smith DM.Adrenomedullin，a multifunctional regulatory peptide ［J］.Endocr Rev，2000，21(2):138－167.

［3］Matheson PJ，Mays MP，Hurt RT，et al.Adrenomedullin is increased in the portal circulation during chronic sepsisin rats［J］.Am J Surg，2003，186(5):519 －525.

［4］Jougasaki M，Wei CM，McKinley LJ，et al.Elevation of circulating and ventricular adrenomedullin in human congestive heart failure［J］.Circulation，1995，92(3):286 －289.

［5］Mukherjee R，Multani MM，Sample JA，et al.Effects of adrenomedullin on human myocyte contractile function and β －adrenergic response［J］.J Cardiovasc Pharmacol T-her，2002，7(4):235 －240.

［6］Zhang XH，Li GR，Bourreau JP.The effect of adrenomedullin on the L－type calcium current in myocytes from septic shock rats:signaling pathway［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293(5):H2888 －H2893.

［7］Ichinose F，Buys ES，Neilan TG，et al.Cardiomyocytespecific overexpression of nitric oxide synthase 3 prevents myocardial dysfunction in murine models of septic shock［J］.Circ Res，2007，100(1):130 －139.

［8］Yasuda S，Lew WY.Angiotensin II exacerbates lipopolysaccharide－induced contractile depression in rabbit cardiac myocytes［J］.Am J Physiol，1999，276(5 Pt 2):H1442－H1449.

［9］Thompson M，Kliewer A，Maass D，et al.Increased cardiomyocyte intracellular calcium during endotoxin－induced cardiac dysfunction in guinea pigs［J］.Pediatr Res，2000，47(5):669 －676.

［10］Ikenouchi H，Kangawa K，Matsuo H，et al.Negative inotropic effect of adrenomedullin in isolated adult rabbit cardiac ventricular myocytes［J］.Circulation，1997，95(9):2318－2324.

［11］Risφe PK，Wang Y，Stuestφl JF，et al.Lipopolysaccharide attenuates mRNA levels of several adenylyl cyclase isoforms in vivo［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1772(1):32－39.

［12］Matsuda N，Hattori Y，Akaishi Y，et al.Impairment of cardiac β－adrenoceptor cellular signaling by decreased expression of Gsαin septic rabbits［J］.Anesthesiology，2000，93(6):1465－1473.

［13］Ogletree－Hughes ML，Stull LB，Sweet WE，et al.Mechanical unloading restores β－adrenergic responsiveness and reverses receptor downregulation in the failing human heart［J］.Circulation，2001，104(8):881 －886.

［14］He JQ，Balijepalli RC，Haworth RA，et al.Crosstalk of beta－adrenergic receptor subtypes through Giblunts β －adrenergic stimulation of L－type Ca2+channels in canine heart failure［J］.Circ Res，2005，97(6):566 －573.

［15］Bendall JK，Damy T，Ratajczak P，et al.Role of myocardial neuronal nitric oxide synthase－derived nitric oxide in β－adrenergic hyporesponsiveness after myocardial infarction －induced heart failure in rat［J］.Circulation，2004，110(16):2368－2375.

［16］Xu Y，Krukoff TL.Adrenomedullin stimulates nitric oxide production from primary rat hypothalamic neurons:roles of calcium and phosphatases［J］.Mol Pharmacol，2007，72(1):112－120.