大鼠組織工程人工骨的體外動態灌注培養構建

張 波 權 毅 謝慶云 潘顯明 伍紅樺 趙凱敏 屈 波 廖冬發 鄧 斌

(解放軍成都軍區總醫院骨科，四川 成都 610083)

創傷及多種原因造成的骨缺損病變日益增多，影響患者活動和勞動能力。隨著近年構建工程化組織研究的不斷深入，人們發現適當的力學刺激因素可以克服傳統骨細胞培養條件的不足，滿足細胞在可吸收細胞外基質(ECM)中營養的需要，減少處于中心部位的細胞由于營養不良或代謝不暢而導致的生長遲滯甚至死亡〔1，2〕。因此，研究力學刺激對體外三維立體培養細胞的作用有重要意義。本文探討采用動態灌注培養方法應用骨髓間充質干細胞(MSC)在納米復合羥基磷灰石接枝聚乳酸(HA/PLA)材料構建SD大鼠骨組織的效果與應用價值。

1 材料與方法

1.1 支架材料 生物活性可降解HA/PLA納米復合多孔材料由四川大學提供，該復合材料在PLA上接枝HA和具有促進細胞黏附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，其孔隙率為93% ～95%，孔徑為400～650 μm，壓縮強度為120 mPa，壓縮模量0.8 Gpa。制成直徑為20 mm，厚度5 mm圓片，環氧乙烷熏蒸消毒后備用。

1.2 原代培養 取10月齡SD大鼠(由四川大學實驗動物中心提供)適應性飼養2 w，參照文獻方法取股骨骨髓〔3，4〕，用低糖DMEM培養基(含10%胎牛血清)原代分離培養MSC，傳至第3代，分別按照2×104和2×105ml－1密度接種于多孔支架上。

1.3 灌注實驗 灌流培養系統由樣品池、蠕動泵、硅膠管道以及培養液瓶組成。分別在0.3，0.6和0.9 ml/min灌注速度實驗。并于灌流培養7 d取出細胞/支架復合物，通過MTT法檢測細胞生長增殖情況。

1.4 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測 培養15 d后取細胞支架復合物，切碎，反復凍融法裂解細胞，取裂解液30 μl與0.5 ml緩沖液及0.5 ml基質液充分混勻，37℃水浴15 min，按照試劑盒說明書加入1.5 ml顯色劑，混勻，在520 nm處測各管吸光度。1.5 形態學觀察 于灌注培養第15天取出細胞支架復合物，PBS清洗，從中間切開，加熒光素二乙醋，37℃孵育5 min后，PBS洗滌，顯微鏡觀察細胞形態。另一部分細胞/支架復合物，經固定、梯度脫水、石蠟包埋后，切片(厚度6 μm)，行HE染色，顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 灌注培養對細胞增殖的影響 MTT檢測結果顯示，與靜止培養相比較，灌注培養7 d細胞在支架中的活力顯著增加，且細胞活力隨著接種細胞密度的增大而增加，表明灌注培養可以促進細胞增殖。在相同細胞密度條件下，中速(0.6 ml/min)與快速灌注(0.9 ml/min)較慢速(0.3 ml/min)顯著促進細胞生長;中速與快速灌注對細胞增殖影響差別不顯著。通過正交法表明最佳培養條件為:細胞密度2×105ml-1，灌注流速為0.6或0.9 ml/min。

表1 MTT法測定不同接種密度MSC在不同灌注速度增殖情況(，n=3)

表1 MTT法測定不同接種密度MSC在不同灌注速度增殖情況(，n=3)

與0.3 ml/min比較:1)P＜0.05;與對照組比較:2)P＜0.05

組別 2×104ml－1 0 0.3 ml/min 0.6 ml/min 0.9 ml/min 2×105ml-1 0 0.3 ml/min 0.6 ml/min 0.9 ml/min實驗組 － 0.47±0.052) 0.57±0.041)2) 0.59±0.051)2) － 0.83±0.05 0.95±0.061)2) 0.98±0.051)2)對照－組0.39±0.04 － － － 0.71±0.06 － －

2.2 ALP活性檢測 分別于體外培養15 d取樣，切碎，經組織勻漿，使用ALP測定試劑盒進行ALP活性檢測。在接種細胞密度為2×105ml-1時，與靜止培養(0.007±0.001)比較，灌注培養(灌注速度為0.6 ml/min)骨組織ALP活性(0.063±0.001)明顯增高，證明實驗組更能促進MSC向成骨細胞分化。

2.3 灌注培養對骨組織形態的作用 熒光和HE染色可見成骨細胞在支架中均勻分布，證明通過MSC誘導分化成骨細胞能夠在HA/PLA三維多孔支架上生長。與對照組相比，實驗組細胞數量和密度更大，因而可以推斷出灌流培養產生的剪切力更適合人工骨組織構建，用灌注生物反應器系統來進行MSC的三維立體擴增和分化是可行的，可以用于骨組織工程研究。

3 討論

組織工程為修復骨缺損提供了一個新的思路和方法。種子細胞在復合支架材料上通過體外擴增、共培養，形成與骨組織結構與功能相似的新生組織來修復骨缺損。MSC是一種理想的組織工程種子細胞。體外培養的MSC具有強大的增殖能力，而且具有多向分化潛能。支架中生長的細胞首先要能夠分布均勻，以獲得均勻的新生組織。多孔支架應具有促進細胞黏附、增殖和分化的功能，以提高新生組織的生成速度。PLA及其共聚物具有良好的生物降解性和組織相容性，在軟骨和骨組織工程應用中顯示出較好的性能而被廣泛應用。本文采用的生物活性多孔 HA/PLA，在合成高分子 PLA上接枝 HA和RGD，既有骨修復成分HA，又有增強細胞黏附的短肽序列。結果顯示，生物活性HA/PLA支架能夠促進MSC黏附和遷移。將MSC以一定的密度接種到HA/PLA支架中后進行灌流培養，細胞保持了較高的活力和增殖活性，基質分泌旺盛。由此證明，對于MSC的三維立體培養和擴增是高效、可行的。

灌注式培養利用細胞營養液流經支架材料的孔隙給細胞提供足夠的物質輸送，同時提供一定的機械剪應力刺激作用，適合大塊組織的體外構建。對比于靜態培養，灌注反應體系可促進細胞的活力和功能，增強成骨分化而且使細胞在支架內的分布更均勻。

1 宋 飛，梅冠宇，宋克東，等.成骨細胞不同體外培養方式的耗氧速率檢測〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2008;12(24):4606-9.

2 閆香珍，楊丕山.骨組織工程技術瓶頸及其原因分析〔J〕.國際口腔醫學雜志2009;36(1):117-9.

3 田 甜，章慶國.力學刺激促進軟骨細胞與骨髓基質干細胞共培養體外軟骨分化〔J〕.中國美容醫學，2009;18(5):658-62.

4 陳 鵬，劉 冰，毛天球.納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸材料復合自體骨髓基質細胞修復犬下頜骨節段性缺損的實驗研究〔J〕.北京口腔醫學，2009;17(4):195-8.