二苯乙烯苷對H2O2誘導PC12細胞損傷的抗氧化作用

王 婷 熊章鄂(三峽大學醫學院藥理學教研室，湖北 宜昌 443002)

ROS介導的病理損傷與多種年齡相關的神經系統疾病的發病機制密切相關。在伴有輕度認知能力損傷、阿爾茨海默病和血管性癡呆的患者中都可觀察到脂質過氧化產物的升高和抗氧化物水平的降低〔1，2〕。二苯乙烯苷(TSG)是從抗衰老中藥蓼科植物何首烏的干燥塊根中提取分離得到的一種多酚結構的水溶性、何首烏的主要有效成分〔3〕。研究表明，TSG具有抗氧化和清除自由基的作用〔4〕。嗜鉻細胞瘤細胞系(PC12)細胞是來自大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤的克隆細胞系，作為細胞模型已被廣泛應用于神經退行性疾病的研究。本研究采用H2O2損傷的體外培養模型，觀察TSG對H2O2誘導PC12神經細胞系氧化損傷的保護作用，為其應用于神經退行性疾病的治療提供有力的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 TSG(C20H22O9)，分子量:406，純度大于98%，購自中國藥品生物制品檢定所。DMEM/F12培養基，胎牛血清(FBS)，胰酶購自Gibco公司。MTT，DCFH-DA購自Molecular Probes公司。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。其余試劑均為國產市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞培養 PC12細胞由華中科技大學同濟醫學院藥理系陳建國教授惠贈，本實驗室傳代保種。使用含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的 DMEM/F12 完全培養基，在37℃，95%O2和5%CO2培養箱中進行培養，每3天全量更換一次培養基，待細胞鋪滿培養瓶底80%以上時，按1∶4的比例將細胞傳代至多聚賴氨酸的培養瓶或培養板上，以備實驗用。

1.2.2 MTT法測定細胞存活率 細胞按合適的密度接種于96孔板，隨機分為:正常對照組、H2O2處理組和 TSG(0.1，1，10，50 μmol/L)組。加入不同濃度的TSG預孵育細胞12 h后，再加入120 μmol/L H2O2誘導細胞24 h，進行MTT實驗。在避光條件下，每孔加入MTT 0.5 mg/ml，繼續培養4 h，棄上清后每孔加DMSO 100 μl，振蕩10 min，于酶標儀上測波長為490 nm時的吸光度值(A)。A值為活細胞將MTT還原為藍色結晶物formazan的光吸收值，在一定細胞數范圍內與活細胞數成正比，間接反映活細胞數。各組細胞存活率(%)=(試驗組A值/對照組A值)×100%，從而得出各組細胞存活率。

1.2.3 細胞內ROS水平測定 細胞按合適的密度接種于96孔板，分組及處理同上。去除細胞培養液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L，37℃培養箱內孵育20 min，用無血清細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。DCF的熒光強度用Cytofluor2350熒光酶標儀檢測，激發波長為488 nm，發射波長525 nm，DCFH的熒光代表了細胞內的ROS水平。

1.2.4 細胞內SOD、GSH-Px活性及MDA含量的測定 胰酶消化收集細胞后用超聲裂解細胞，獲取細胞勻漿。SOD活性測定依據黃嘌呤氧化酶法的原理，GSH-Px的活性測定根據Mill's法，MDA含量的檢測依據硫代巴比妥酸(TBA)法。

1.3 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件，數據用x± s表示，多組間顯著性比較用單因素方差分析(ANOVA)結合Duncan's檢驗法。

2 結果

2.1 TSG抑制 H2O2誘導的 PC12細胞損傷 120 μmol/L H2O2作用24 h后，PC12細胞的存活率(0.36±0.05)降低到正常對照組的〔0.67±0.04，(54±6)%〕。TSG(0.1，1，10，50 μmol/L)預處理細胞12 h能夠濃度依賴性的降低H2O2誘導的PC12細胞損傷，其存活率分別為0.37±0.02，0.43±0.03，0.51 ±0.06，0.55 ±0.03。

2.2 TSG降低H2O2引起的細胞內ROS水平增高 H2O2處理PC12細胞24 h后，細胞內DCF熒光明顯增強(6 182±392)，為正常對照組(3 454±321)的180% ±10%，提示細胞內ROS 水平增高。不同濃度的 TSG(0.1，1，10，50 μmol/L)預孵育細胞12 h后，再用120 μmol/L H2O2誘導細胞，能夠劑量依賴性的拮抗H2O2引起的細胞內DCF熒光增高。其ROS的DCF熒光強度分別為6 148±241，5 320±274，4 870±310及4 697±238。

2.3 TSG對PC12細胞內抗氧化酶活性的影響 H2O2處理PC12細胞24 h后，細胞內SOD和GSH-Px的活性減少。TSG預處理12 h可以明顯對抗H2O2誘導的抗氧化損傷作用。見表1。

表1 TSG對PC12細胞內脂質過氧化產物含量的影響(，n=6)

表1 TSG對PC12細胞內脂質過氧化產物含量的影響(，n=6)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別SOD(U/mgpro)GSH-Px(U/mgpro)MDA(nmol/mgpro)28.0±2.7 47.1±6.6 4.3±0.5 H2O2模型組 15.7±1.91)24.9±3.81) 7.6±0.81)H2O2+TSG 0.1 μmol/L組 15.9±2.2 25.8±3.1 7.4±0.7 H2O2+TSG 1 μmol/L組 17.1±2.3 28.7±4.3 6.7±0.42)H2O2+TSG 10 μmol/L組 19.8±1.93)35.7±3.73) 6.5±0.53)H2O2+TSG 50 μmol/L組 21.6±2.53)39.5±2.83) 5.6±0.53)正常對照組

2.4 TSG對PC12細胞內脂質過氧化產物含量的影響 H2O2處理PC12細胞24 h后，使細胞脂質過氧化產物MDA的含量增加，不同濃度的TSG預處理細胞后可逆轉H2O2所致細胞脂質過氧化產物MDA的含量增加。見表1。

3 討論

氧化應激是細胞氧化-抗氧化失衡而導致的應激損傷狀態。當ROS的生成增加而其清除減少或者對氧化修飾的大分子修復減少時，氧化應激就會發生。ROS的過度產生可以導致一系列的細胞功能損傷。氧化應激對神經元的損傷主要表現在以下幾個方面;細胞膜發生脂質過氧化反應，膜磷脂被破壞降解;細胞膜對鈉、鈣及大分子物質通透性增加，神經元發生細胞毒性水腫〔5〕;線粒體破壞，功能喪失〔6〕。攻擊細胞內的 RNA和DNA，影響細胞的基因轉錄和蛋白表達過程〔7〕。

H2O2是一種膜通透性的ROS，是研究氧化應激的理想模型。本研究采用H2O2損傷的體外細胞培養模型研究了TSG的細胞保護作用。實驗結果表明，從何首烏中提取的單體成分TSG能提高H2O2誘導的PC12細胞的存活率，減輕細胞損傷。同時，減輕細胞內ROS累積，增強抗氧化酶SOD和GSH-Px的酶活性，降低細胞內脂質過氧化產物MDA的含量。因此推測，TSG對H2O2誘導的PC12細胞的保護作用部分是通過抑制胞內氧化應激反應來實現的。

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