脾虛證進程中小鼠特異性/非特異性免疫功能變化及中藥的干預作用

段永強 成映霞 程 容 梁玉杰 朱立鳴 (甘肅中醫學院基礎課部，甘肅 蘭州 730020)

現代醫學已證明衰老進程中主要伴隨著機體免疫功能的紊亂或低下，進而導致組織器官功能障礙和代謝廢物的堆積。而且中醫學所論之“脾”包涵著豐富的免疫學內容，脾虛證與機體免疫器官、非特異性免疫、體液免疫、細胞免疫以及免疫遺傳學等方面異常改變均有顯著相關性〔1〕。脾腎兩虛是中醫學關于衰老的主要病機之一，健脾補腎已成為歷代醫家延緩衰老和治療虛勞病癥的重要法則。敦煌大寶膠囊(DHDB)是從敦煌石窟遺書中選方化裁，由熟地、黃芪、當歸、茯苓、大黃等藥味提取加工組成，具有健脾益氣、強腎填精、滌痰祛瘀、安和五臟的功效。該制劑經臨床應用顯示能夠有效防治各種虛勞病癥，前期研究表明〔2，3〕DHDB具有提高衰老大鼠腦組織細胞膜鈉泵活性，拮抗自由基損傷而保護細胞的功能，為進一步探討該藥對脾虛證的干預效應，本研究觀察了脾虛證進程中小鼠部分特異性/非特異性免疫功能的變化及DHDB囊的作用效應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 采用SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，鼠齡5 w，體重(20±1)g，由甘肅中醫學院醫學實驗中心提供，SPF級動物合格證號:SCXK(甘)2004-0006-0000201;SPF級實驗設施合格證:SYXK(甘)2004-0006-000092。受試動物按體重編號，采用隨機數字表法〔4〕分為空白對照組、模型組、DHDB大劑量組、DHDB中劑量組、DHDB小劑量組、補中益氣丸組(表示為“陽性對照組Ⅱ”)，每組8只，雌雄各半，分籠飼養。

1.1.2 藥品試劑與儀器 DHDB(院內制劑，批號040925);補中益氣丸(陽性對照組Ⅱ，蘭州佛慈制藥廠生產，批號20040912);RPMI 1640培養基(Sigma公司，批號:20050109);聚羥基脂肪酸酯(PHA)(Sigma公司，批號:20050106);刀豆球蛋白 A(Cloncanavalin，ConA，Sigma公司，批號:20050109);脂多糖(Lipopoly Saccharide，LPS，Sigma 公司，批號:20050109);MTT(瑞士Fluka公司，批號:20050224);新生牛血清(上海華美生物工程公司，批號:20050210);淋巴細胞分離液(上海華精生物高科技有限公司，批號:20050208);CO2恒溫培養箱(規格型號:MCO-15AC，日本SANYO);酶聯免疫檢測儀(規格型號:BENCHMARK PULS，美國BIO-RAD);電熱恒溫培養箱(規格型號:L-303)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法及給藥 脾虛模型的建立〔5〕:空白對照組每日灌胃等量蒸餾水外，其余小鼠以0.2 ml/10 g生大黃液(每ml含生藥1 g)灌胃，每日2次，連續8 d?？瞻讓φ战M、脾虛模型組給予同體積蒸餾水灌胃;DHDB大、中、小劑量組分別予0.8，0.4和0.16 g·kg－1·d－1DHDB藥劑灌胃，等效劑量按人與動物體型系數折算〔6〕(相當于成人劑量的10倍、5倍和2倍);給予陽性對照組Ⅱ0.4 g·kg－1·d－1補中益氣丸藥劑灌胃(相當于成人劑量的5倍)。各組均以蒸餾水、標準飼料喂養。連續灌胃14 d，給藥容積為0.15 ml/10 g體重。

1.2.2 指標檢測及方法

1.2.2.1 DHDB對脾虛證小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數的影響 動物分組給藥及模型的建立同“1.2.1”。于末次給藥后1 h，每只小鼠腹腔注射5%雞紅細胞懸液1 ml，30 min后頸椎脫臼處死，正中剪開腹壁皮膚，取1 ml生理鹽水灌洗腹腔，吸出灌洗液0.5 ml，平均分滴于2張載玻片上，用生理鹽水漂洗，以除去未貼壁細胞，自然干燥，甲醇溶液固定，加入瑞氏染液染色1 min，滴加pH 6.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)與染液混勻，靜置5 min，自來水沖去染料，干燥后鏡下觀察計數。計算吞噬百分率=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞/計數的巨噬細胞×100%;吞噬指數=被吞噬的雞紅細胞總數/計數的巨噬細胞×100%。

1.2.2.2 DHDB對ConA，LPS誘導脾虛小鼠T、B淋巴細胞增殖反應的影響 動物分組給藥及模型的建立同“1.2.1”。于末次給藥1 h后，頸椎脫臼處死動物，無菌取脾組織，用Hank's液制成6×107/ml脾細胞懸液。于4×10孔滅菌培養板上分別加入ConA或LPS 100 μl，再按實驗動物組別，加入相應脾細胞100 μl，ConA終孔濃度為7.5 μg/ml。LPS終孔濃度為7.8 μg/ml。將培養板置5%CO2培養箱中，37℃飽和濕度下，培養48 h。各孔加入MTT 10 μl后，在上述條件下繼續培養4 h。吸去各孔上清液，加入100 μl DMSD，于酶聯免疫監測儀在570 nm處測光密度值，作為反映淋巴細胞增殖程度的指標。

1.2.2.3 DHDB對脾虛證小鼠NK細胞活性的影響 動物分組給藥及模型的建立同“1.2.1”。于末次給藥后1 h，脫臼處死小鼠，無菌條件取脾，用眼科剪刀剪碎，75 μm篩網過濾，制成單個脾細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去上清，低滲除去紅細胞，1 000 r/min離心5 min，去上清，用生理鹽水制成單細胞懸液，并稀釋至3.0×103個/L。靶細胞取K562體外培養細胞，常規培養24 h，以培養液調整細胞濃度為1.5×102個/L，使效靶細胞比為20∶1。取96孔培養板分別加入效應細胞和靶細胞，另設效應細胞和靶細胞對照，于37℃ 體積分數為5%的CO2條件培養12 h后，加入MTT染色液，再培養4 h后，甩板，加入DMSO搖勻，用酶聯免疫檢測儀在570 nm測吸光度值。NK細胞活性(%)=〔TO－(S－E)〕/TO×100%，式中TO為靶細胞對照孔吸光度值，S為實驗孔吸光度值，E為效應細胞孔吸光度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行處理，組間計量資料比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 DHDB對脾虛證小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數降低(P＜0.05);與模型組比較，DHDB各組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數升高(P＜0.05)。見表1。

表1 DHDB對脾虛小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率/吞噬指數，ConA，LPS誘導T、B淋巴細胞增殖反應和NK細胞活性的影響(n=8，)

表1 DHDB對脾虛小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率/吞噬指數，ConA，LPS誘導T、B淋巴細胞增殖反應和NK細胞活性的影響(n=8，)

與空白對照組相比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 劑量(g/kg) 吞噬百分率(%) 吞噬指數 OD值(570 nm)ConA LPS NK細胞活性(%)空白對照組 同體積溶媒 44.70±4.97 0.82±0.14 0.80±0.15 0.69±0.10 24 22.41±3.81.53±4.91模型組 同體積溶媒 39.00±4.491) 0.69±0.111) 0.57±0.211) 0.49±0.092) 19.45±4.641)DHDB大劑量組 0.80 42.51±5.79 0.73±0.09 0.79±0.143) 0.63±0.123) 21.18±5.00 DHDB中劑量組 0.40 44.27±6.073) 0.78±0.123) 0.72±0.20 0.51±0.15 23.79±3.853)DHDB小劑量組 0.16 39.67±4.96 0.71±0.07 0.63±0.19 0.46±0.16 22.63±3.01陽性對照組Ⅱ 0.40 43.18±5.653) 0.81±0.083) 0.78±0.183) 0.66±0.134)

2.2 DHDB對ConA，LPS誘導脾虛小鼠T、B淋巴細胞增殖反應的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠ConA誘導的T淋巴細胞增殖和LPS誘導的B淋巴細胞增殖計數水平降低，對比組間的差異具有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01);與模型組比較，DHDB各組小鼠ConA誘導的T淋巴細胞增殖和LPS誘導的B淋巴細胞增殖計數水平升高，對比組間的差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 DHDB對脾虛證小鼠NK細胞活性的影響與空白對照組比較，模型組小鼠NK細胞活性降低，對比組間的差異具有統計學意義(P＜0.05);與模型組比較，DHDB各組小鼠NK細胞活性升高，對比組間的差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

3 討論

研究表明中醫學的“脾”包涵著豐富的免疫學內容，而脾虛證與免疫器官、非特異性免疫、體液免疫、細胞免疫以及免疫遺傳學等方面異常改變均有顯著相關性〔1〕。脾臟是外周免疫器官，脾臟內含大量由骨髓干細胞發育而來的B細胞和大量T細胞、巨噬細胞，是各種免疫細胞居住、增殖并進行免疫應答及產生免疫效應物質，合成巨噬細胞增強激素的主要場所?！捌⑻撟C”一般有腹腔巨噬細胞吞噬功能及分泌白細胞介素-1(IL-1)等的能力下降。巨噬細胞不僅通過吞噬、殺傷和消化病原微生物等抗原物質發揮非特異性免疫功能，而且通過分泌多種細胞因子，提示抗原啟動特異性免疫應答及抗腫瘤等作用參與特異性免疫應答的各階段。脾虛時單核吞噬細胞功能下降，說明脾虛證機體非特異性免疫功能失調，腹腔巨噬細胞功能下降是脾虛證免疫機能失調的重要機制之一〔7，8〕。

淋巴細胞增殖和分化是機體免疫應答過程的一個重要階段。因此檢測淋巴細胞增殖水平是細胞免疫研究和臨床免疫功能檢測的一種常用方法。T細胞、B細胞表面具有識別抗原的受體和有絲分裂原受體，在特異性抗原刺激下可使相應淋巴細胞克隆發生增殖。ConA和LPS是T、B淋巴細胞特異性較強的活化刺激劑，在ConA和LPS活化條件下，起反應的主要是T細胞和B細胞。

NK細胞活性代表機體的天然防御功能，其對靶細胞的作用范圍遠大于殺傷性T細胞，能殺傷某些病毒感染細胞，而對正常未感染細胞無殺傷作用。同時是機體維持免疫監視功能的主要細胞，通過釋放淋巴因子如干擾素(IFN-α)、IFN-γ、IL-2等對T、B細胞、骨髓干細胞進行免疫調節，有助于機體自身穩定。研究表明脾虛小鼠NK細胞功能明顯降低，自身穩定遭受嚴重破壞〔9〕。

DHDB以熟地黃和黃芪兩味為君而健脾益精、補益氣血;輔用當歸補血活血為臣而養心脾益肝腎;茯苓補脾益胃，淡滲利水去濕而祛痰，補中有動，以防補氣藥過于壅滯為之佐藥。全方共奏后天脾胃培補先天之腎，先天之腎資助后天脾胃，氣血同源互生互化，力求固元培本而健脾益氣。本方特色是應用小劑量大黃以通為補，通利腸胃。現代藥理學證明熟地黃、黃芪、當歸、大黃均對機體免疫功能具有正向調節作用〔10～13〕。本研究表明DHDB可顯著提高脾虛證小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數，顯著提高脾虛證小鼠NK細胞活性(P﹤0.05);在DHDB作用下，脾細胞對ConA和LPS刺激的增殖反應均有增強(P﹤0.05)，提示DHDB既能增強T細胞反應，又能增強B細胞反應，具有提高機體免疫功能的作用。

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3 段永強，成映霞.敦煌石室大寶膠囊對衰老大鼠腦組織MAO-B、Na+-K+-ATP酶活性的影響〔J〕.甘肅中醫學院學報，2005;22(3):26-9.

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5 曲長江，林庶如，夏淑杰，等.苦寒瀉下兩種脾虛模型的免疫學比較研究〔J〕.遼寧中醫雜志，1999;26(3):133.

6 陳 奇.中藥藥理研究方法學〔M〕.北京:人民衛生出版社，1993:33-4.

7 章 梅，夏 天，張仲海，等.四君子湯對脾虛患者血漿細胞因子的影響〔J〕.第四軍醫大學學報，2000;21(4):411-3.

8 陳 勇，吳敏毓.防己黃芪湯對脾虛小鼠Mφ、T細胞功能的影響〔J〕.安徽中醫學院學報，2000;19(1):48-50.

9 吳敏毓，米 娜，孫衛民.補中益氣湯拆方組份對脾虛小鼠免疫調節作用〔J〕.中國臨床藥理學與治療學雜志，1997;2(2):114-6.

10 蔡 晶.地黃的藥理作用實驗研究進展〔J〕.國際中醫中藥雜志，2007;29(3):164-6.

11 鄭秀琴.黃芪的免疫調節作用及其臨床應用〔J〕.云南中醫中藥雜志，2007;28(7):30-1.

12 何 立.當歸對神經和免疫系統作用的研究現狀與展望〔J〕.時珍國醫國藥，2007;18(9):2282-4.

13 張秀明.茯苓藥理作用研究概況〔J〕.中藥材，2001，24(6):446-8.