四君子湯對衰老小鼠腦組織caspase-3表達及活性的影響

王懷穎 石少慧 張晶晶 張 悅 史建紅 (河北大學基礎醫學院生化教研室，河北 保定 071000)

細胞凋亡是由基因控制的細胞主動死亡過程，在維持機體生理穩態和生長發育中發揮重要作用，同時也參與多種疾病的病理過程。caspase蛋白酶家族在細胞凋亡中發揮重要作用，其中caspase-3是細胞凋亡過程中一個關鍵分子，是細胞凋亡執行者之一〔1〕。四君子湯是益氣健脾的經典方劑，源于宋代《太平惠民和劑局方》。現代藥理學研究發現，該方能提高機體抗氧化酶活性，調節代謝、內分泌及免疫功能等〔2〕。本實驗擬觀察四君子湯對衰老小鼠腦組織caspase-3表達及活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性KM小鼠，購自河北省實驗動物中心(合格證號804064)。

1.1.2 藥品及試劑 caspase-3一抗購自Santa Cruz公司，SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司，caspase-3檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.1.3 四君子湯制備 四君子湯由黨參、白術、茯苓、炙甘草按2∶2∶2∶1組成，剪碎、浸泡、水煎，收集濾液，濾渣再次加水煎煮，合并兩次濾液，濃縮至2 g/ml，4℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 雄性KM小鼠分為青年對照組(3月齡)、老年對照組(12月齡)和四君子湯組(12月齡)，每組10只。四君子湯組每日灌胃四君子湯12 g/kg，其余兩組灌胃等量蒸餾水，共8 w。8 w后，斷頭處死動物，冰臺上剝離一側海馬，置4%多聚甲醛溶液固定。剝離另一側腦組織－70℃冰箱保存，待檢測caspase-3活性。

1.2.2 免疫組化法檢測海馬caspase-3表達 固定的海馬組織石蠟包埋，5 μm 切片，脫蠟至水，3%H2O210 min，37 ℃抗原修復10～20 min，血清封閉20 min，滴加caspase-3一抗，4℃過夜。再依次滴加生物素偶聯的二抗和辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復染，透明，封片，光鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照，陽性信號以胞質出現棕黃色顆粒判斷。

1.2.3 免疫組化評分方法 參照文獻〔3〕，結合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面評分:a為陽性細胞百分比(無陽性細胞 =0，陽性細胞1% ～10%=1，11% ～50%=2，51% ～80%=3，81% ～100%=4)，b為陽性細胞染色強弱(陰性=0，弱陽性=1，中度陽性=2，強陽性=3)，ab兩項乘積為該例組織的免疫組化評分。

1.2.4 腦組織caspase-3活性測定 取一側腦組織加入適量裂解液制備成組織勻漿。4℃，12 000 r/min離心20 min，取上清液進行測定。具體操作按試劑盒說明書進行。蛋白定量用Bradford法。

2 結果

2.1海馬caspase-3表達 caspase-3主要在小鼠海馬錐體神經元胞質表達。老年小鼠海馬caspase-3陽性細胞明顯多于青年對照組(P＜0.05)。與老年對照組比較，四君子湯組小鼠海馬caspase-3表達明顯下降(P＜0.05)。見表1，圖1。

2.2 腦組織caspase-3活性 與青年對照組比較，老年小鼠腦組織caspase-3活性升高，有顯著性差異(P＜0.01)。四君子湯組小鼠腦組織caspase-3活性顯著低于老年對照組(P＜0.01)。見表2。

表1 不同組別小鼠海馬caspase-3表達的變化(n=5)

表2 不同組別小鼠腦組織caspase-3活性的比較(，n=10)

表2 不同組別小鼠腦組織caspase-3活性的比較(，n=10)

1)與青年對照組比較，P＜0.01，2)與老年對照組比較P＜0.01

組別 caspase-3活性(U/mgprot)22.064±4.640老年對照組 39.492±9.9501)四君子湯組 21.170±5.7152)青年對照組

圖1 各組小鼠海馬caspase-3表達(DAB，×400)

3 討論

研究表明，進入老齡，心、腦、肝等多種組織器官細胞凋亡過度增加，導致相應組織器官功能下降，進一步加快衰老進程，因此細胞凋亡是衰老發生的一個重要原因〔4，5〕。細胞凋亡的發生最終依賴caspase家族蛋白酶的活化，其中caspase-3是多條細胞凋亡途徑的交匯點，是凋亡信號的主要執行者。

Caspase-3以酶原形式存在于胞質中，被激活后，可水解多種胞質、胞核蛋白，破壞細胞骨架蛋白及與DNA損傷修復有關的蛋白質，導致細胞皺縮，DNA裂解，形成凋亡小體〔6〕。Baker等發現，雄性大鼠增齡過程中跖肌 caspase-3，caspase-8，caspase-9表達增多，其活性高低與肌肉減少程度呈正相關〔7〕，說明caspase-3活性高低可反映細胞凋亡速度。本研究顯示，增齡過程中，實驗動物海馬均有caspase-3表達，腦組織可檢測出caspase-3活性。老齡小鼠腦組織caspase-3表達及活性均高于青年對照組。

四君子湯是中醫學健脾益氣的代表方劑，有“輕身延年”之功效，楊靖等發現四君子湯能拮抗自由基損傷，減少D-半乳糖衰老模型小鼠多種組織氧化應激水平〔2〕。自然衰老小鼠補充四君子湯后，可顯著抑制海馬caspase-3表達，降低腦組織caspase-3活性，減慢細胞凋亡速度。本研究認為，四君子湯可減少或抑制腦組織神經元細胞過度凋亡，達到延緩衰老的目的。

1 Chen XX，Li J，Wu JR，et al.Effects of mild hypothermia on levels of Bcl-2，caspase-3 and apoptotic neurosin hippocampus CA1area after forebrain ischemia in gerbils〔J〕.Chin Pharmacol Bull，2007;23(1):77-81.

2 楊 靖，詹向紅，孫 曄，等.四君子湯對D-半乳糖衰老模型小鼠心、肝、腦組織MDA含量及端粒酶活性的影響〔J〕.中國中西醫結合雜志，2005;25(6):531-3.

3 Geng YJ，Ishikawa Y，Vatner DE，et al.Apoptosis of cardic myocytes in Gsalpha transgenic mice〔J〕.Circ Res，1999;84(1):34-42.

4 Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al.Cox-2 is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors〔J〕.Cancer，2000;89(12):2637-45.

5 裴 媛，李德新，孫松輝.獨活及其醇提取物對自然衰老小鼠腦組織細胞凋亡的影響〔J〕.中國老年學雜志，2005;25(8):959.

6 Granville DJ，Shaw JR，Leong S，et al.Release of cytochrome c，Bax migration，Bid cleavage，and activation of caspase2，3，6，7，8 and 9 during endothelial cell apoptosis〔J〕.Am J Pathol，1999;155(4):1021-5.

7 Baker DJ，Hepple RT.Elevated caspase and AIF gene expression correlatewith progression of sarcopenia during aging in male F344BN rats〔J〕.Exp Gerontol，2006;41(11):1149-56.