CCL3L1基因拷貝數(shù)目變異與慢性乙肝的易感性相關*

鄭靈燕， 裴元元， 李淼新， 周 翔， 黃瑋俊， 丁紅珂， 王一鳴△

(1中山大學中山醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室，廣東 廣州 510080;2香港大學精神病學系，腦與認知科學國家重點實驗室，中國 香港)

乙型病毒性肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染而引起的以肝臟損害為主要表現(xiàn)的關系到全球公共衛(wèi)生的重大疾病，尤其在發(fā)展中國家。我國是乙肝的高發(fā)國家，據(jù)衛(wèi)生部2006年的統(tǒng)計，我國人群中乙肝表面抗原 (hepatitis B surface antigen，HBsAg)的陽性率為 7.18%(http://www.chinacdc.cn/n272442/n272530/n3479265/n3479303/37089.html)。

拷貝數(shù)目變異(copy number variations，CNVs)是近年來新揭示的一類基因組變異，含相應基因組節(jié)段的缺失、重復及復雜重排等［1］，是疾病發(fā)生的重要遺傳學基礎。拷貝數(shù)目變異的基因組節(jié)段占整個人類基因組的12%［2］，覆蓋人類基因組中13%的基因及5%以上的編碼序列［3］。現(xiàn)已證明拷貝數(shù)目的變異與精神分裂癥［4］、自閉癥［5］等疾病相關。

CCL3L1(chemokine CC motif ligand 3－like 1;RefSeq NM_02l006)基因編碼CCL3L1蛋白(UniProt ID∶P16619)。CCL3L1是一種強效的化學趨化性細胞因子，屬于趨化性因子β亞型(CC型)［6］。趨化性細胞因子是一類低分子量的多肽，其受體為7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員。趨化性細胞因子作為細胞間信號傳遞分子，可以調節(jié)免疫應答、參與免疫細胞分化發(fā)育、介導炎癥反應等。科學家對57個不同人種的檢測表明，在各人種中CCL3L1基因均存在拷貝數(shù)目多態(tài)性，如其在白人中的中位數(shù)為2，而在非洲裔黑人中為6，這組學者檢測了45例中國漢族人群CCL3L1基因的拷貝數(shù)目，并報道我國漢族人群的中位數(shù)為4［7］。研究的新進展表明，CCL3L1拷貝數(shù)目變異與艾滋病的易感性及疾病進展、嚴重程度相關［7］，也與丙型病毒性肝炎的易感性相關［8］，2010年一項關于CCL3L1拷貝數(shù)目變異與靜脈吸毒者人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染相關關系的研究顯示HBV是一個協(xié)同因素，HBV血清學陽性能提高HIV的感染率［9］。但還沒有CCL3L1拷貝數(shù)目變異與乙肝相關關系的報道。因此，我們采用大樣本量研究了我國漢族人群中CCL3L1拷貝數(shù)的分布情況，及其與慢性乙肝間的易感性關系，并初步探討可能的機制。

材料和方法

1 研究對象

收集2006年12月－2010年3月間在中山大學第三附屬醫(yī)院感染科住院的慢性乙肝病人。慢性乙肝的診斷按中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會，肝病學分會標準［10］。入選者均排除了其它肝炎病毒的感染、人類免疫缺陷病毒的感染、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎、脂肪肝及妊娠期、正在接受抗結核藥物治療的病人、靜脈吸毒者、不同意加入本項研究者等。最終有1477例乙肝患者入選本項研究。

健康對照來自自愿參與本研究的知情同意者。入選條件為臨床和實驗室檢查證實為健康;所有健康對照均進行了乙肝兩對半(HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb)及丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)的檢測，且證實為非乙肝患者，也非乙肝病毒攜帶者。

2 方法

2.1 CCL3L1基因拷貝數(shù)目檢測 使用ABI 7500實時熒光定量PCR儀(ABI)，用Taqman探針進行實時定量PCR(qPCR)，檢測CCL3L1基因的拷貝數(shù)目。在絕對定量的模式下，選取A431細胞的DNA作為標準品(已知A431細胞雙倍體基因組含2個拷貝的CCL3L1基因)，以2倍濃度差做梯度稀釋，每個濃度均重復3次，同時擴增目的基因CCL3L1及內參照基因β－globin構建標準曲線。CCL3L1基因與管家基因β－globin的引物與探針序列如文獻報道［7］。每一板均做標準品的標準曲線，同時檢測待測樣本的目的基因CCL3L1及內參照基因β－globin，每個樣品均重復3次。利用ABISDS 1.4序列分析軟件，讀取每個樣品的初始模板量，同時計算每板結果的板間差異系數(shù)(板間差異系數(shù)為每一板中CCL3L1基因標準曲線與 β－globin基因標準曲線的斜率比)。CCL3L1的拷貝數(shù)目等于CCL3L1的起始模板量與β－globin的起始模板量的比值，乘以板間差異系數(shù)，再乘以2。此檢測由2個獨立的研究者用雙盲法進行。

2.2 CCL3L1拷貝數(shù)目與其mRNA、編碼蛋白CL3L1生成量及其趨化效力關系的研究 選取拷貝數(shù)為1(n=6)，拷貝數(shù)為2(n=6)，拷貝數(shù)為3(n=6)，拷貝數(shù)為4(n=6)，拷貝數(shù)為5(n=6)，拷貝數(shù)為6(n=6)，拷貝數(shù)為7(n=5)，拷貝數(shù)為8(n=5)的標本(n表示標本例數(shù))。

運用qPCR檢測mRNA的表達量。首先，用Trizol試劑盒(Invitrogen)提取總 RNA;然后用 Super-ScriptTMII RNase H逆轉錄酶(Invitrogen)進行逆轉錄反應;最后，采用試劑盒2×Power SYBR Green Master Mix?(ABI)，在相對定量模式下，選取一個cDNA樣本2倍濃度差做梯度稀釋，擴增目的基因CCL3L1及管家基因GAPDH構建標準曲線，使用ΔΔCt法計算每個待測樣本的相對cDNA量。CCL3L1 cDNA，上游引物為 5'－TCTCTGCAACCAGGTCCTCTC －3'，下游引物為 5'－GGAGGTGTAGCTGAAGCAGCA－3'。GAPDH cDNA，上游引物為 5'－CAGAACATCATCCCTGCC －3'，下游引物為 5'－ GGTGCTAAGCAGTTGGTG －3'。

用Duoset ELISA development system(R＆D Systems)對蛋白產物進行定量分析。先將標準品進行倍比稀釋，用Fluorstar fluorescent plate reader(Tecan)繪制標準曲線;然后通過標準曲線檢測待測樣本的A450，計算樣本的蛋白濃度。每個樣本檢測2次。

用Transwell法檢測不同拷貝數(shù)目的趨化效力［6］。構建Transwell小室，每個外室孔內加入10% 含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，PBS緩沖液可替代DMEM培養(yǎng)基作為陰性對照。用Calcein將活U973細胞染色，每個內室小孔加入已染色的U973細胞約1×105。37℃、5%CO2孵育箱中孵育105 min后，用Fluorstar fluorescent plate reader(Tecan)檢測每個小孔的A490值，每個孔的A值減去陰性對照孔的A值后，計算相對趨化效力。

假定拷貝數(shù)目為1樣品的相對表達量及趨化效力為1，以此計算其它各組樣品的相對表達量以及趨化效力。

3 統(tǒng)計學處理

用中位數(shù)進行統(tǒng)計描述，用Pearson's卡方檢驗檢測CCL3L1基因拷貝數(shù)目變異與乙肝易感性的相關關系。運用Logistic回歸校正性別與年齡后，進一步分析CCL3L1與乙肝易感性的相關關系。

結 果

1 研究對象

表1顯示了病人組與正常對照組的基本臨床資料。收集1477例病人，男女比例為1093∶384。正常對照1023例，男女比例為508∶515。所有研究對象均為中國漢族人。

表1 病人與正常對照的基本臨床資料Table 1.Clinical data of patients and controls

2 我國漢族健康人及慢性乙肝患者CCL3L1拷貝數(shù)目的分布情況

對50例隨機人群進行CCL3L1拷貝數(shù)目的檢測，結果顯示CCL3L1拷貝數(shù)目在我國漢族人群中呈常態(tài)分布，中位數(shù)為4，與美國學者報道的從45例中得到的數(shù)字相同。進一步檢測1477例慢性乙肝病人及1023例健康對照的CCL3L1拷貝數(shù)目，結果病人和健康對照的中位數(shù)均為3，但在較為極端，即拷貝數(shù)目很低及很高的個體中，兩組的分布顯然有差異，見圖1。

3 CCL3L1拷貝數(shù)目與其mRNA、編碼蛋白CL3L1生成量及趨化效力相關關系

圖2顯示了CCL3L1拷貝數(shù)目與其mRNA、編碼蛋白CL3L1生成量及趨化效力相關關系。假定拷貝數(shù)目為1的樣品相對量為1，得到結果如下:CCL3L1 mRNA的表達量與CCL3L1基因拷貝數(shù)目呈正相關(R2=0.97)，CL3L1生成量與CCL3L1基因拷貝數(shù)目呈正相關(R2=0.97)，CCL3L1基因拷貝數(shù)目與其趨化效力呈正相關關系(R2=0.94)。隨著拷貝數(shù)目的增加，mRNA、編碼蛋白CL3L1的生成量及趨化效力也增加，見圖2。

Figure 2.Correlation between copy number of CCL3L1 and its mRNA，protein products and chemotactic effect.圖2 CCL3L1拷貝數(shù)目與其mRNA、CCL3L1蛋白生成量及趨化效力的相關關系

4 CCL3L1基因拷貝數(shù)與乙肝易感性的相關性

利用Pearson's卡方檢驗，在自由度為9的情況下，P＜0.01，提示CCL3L1基因拷貝數(shù)與乙肝相關。運用Logistic回歸校正性別與年齡后，CCL3L1拷貝數(shù)變異依然與乙肝具有相關性(P＜0.01)。

討 論

乙肝為多因素復雜性疾病，其易感性及感染后的轉歸受病毒載量，暴露時間，年齡，性別，父母患病狀況等因素的影響［11，12］。但正如 HIV 感染一樣，機體對乙肝病毒的免疫反應及病毒在體內的復制都受宿主遺傳因素的影響，故遺傳學因素在其易感性及疾病轉歸上起著重要作用［13］。在乙肝遺傳背景的研究中，HLA是最常被報道的基因［13］。

CCL3L1的拷貝數(shù)目分布在各人種中不同，我們大樣本量的CCL3L1拷貝數(shù)目分析獲得了比美國學者基于45例個體的結果更接近真實的分布特點，即在我國漢族人群CCL3L1基因拷貝數(shù)目的中位數(shù)為3，而非美國科學家報道的 4［7］。

CCL3L1是目前已知的存在拷貝數(shù)目變異的免疫基因之一［6，7］。Gonzalez 等［7］的研究發(fā)現(xiàn) CCL3L1拷貝數(shù)目變異與HIV/AIDS易感性相關，低拷貝數(shù)的個體感染HIV的風險升高。相反，曾有報道指出高CCL3L1拷貝數(shù)目的個體，患風濕性關節(jié)炎與川崎病的風險升高［14，15］。此外，Ptacek 等［16］和Mamtani等［17］分別報道CCL3L1拷貝數(shù)目變異與系統(tǒng)性紅斑狼瘡存在相關。2010年，德國科學家報道了CCL3L1拷貝數(shù)目變異與丙型病毒性肝炎(hepatitis C)的相關關系［8］。同一年，愛沙尼亞科學家對CCL3L1拷貝數(shù)目變異與靜脈吸毒者HIV的相關關系研究中，發(fā)現(xiàn)HBV血清學陽性能提高HIV的感染率［9］。本實驗通過研究CCL3L1基因拷貝數(shù)目多態(tài)性與乙肝易感性的相關關系發(fā)現(xiàn)，在中國漢族人群中，低CCL3L1基因拷貝數(shù)目是乙肝發(fā)病的一個危險因素。

CCL3L1作為一種CC型強效的細胞因子，可通過與其受體(D6、CCR3、CCR5)的結合而產生生物學效應［6］。其中CCR5為HIV進入細胞的重要受體之一，有學者提出，高CCL3L1拷貝數(shù)目者之所以不易感染HIV，是由于其編碼的CCL3L1與CCR5結合，封閉了HIV進入人體細胞的途徑。然而，HBV病毒進入人體肝細胞的機制尚未明確，也沒有研究報道肝細胞上有上述受體表達。本研究的實時熒光定量PCR、ELISA和 Transwell實驗結果顯示高拷貝CCL3L1能生成更多的mRNA、蛋白質，并且對淋巴細胞具有更強的趨化性。因此高拷貝的CCL3L1基因對HBV的保護作用可能是讓機體生成更多的趨化因子CCL3L1，從而有助于免疫細胞發(fā)揮其保護作用。

由于我國目前還未有一套健全的乙肝疫苗注射登記系統(tǒng)，所以本研究在健康對照的篩選中未排除注射過乙肝疫苗者，故部分人的保護性作用可能來自于乙肝疫苗。這種在病例－對照研究中使用與病例組交叉的對照(overlapped control)已得到科學界的認可，如英國多項由Wellcome Trust Sanger Institute進行的相關關系研究均使用了生于1958年的對照(即58 birth cohort)，全然不計對照個體的患病狀態(tài)(http://www.wtccc.org.uk/)。由于本項目所采用的樣本量大，在這種情況下仍獲得了陽性結果，這進一步證實了CCL3L1基因拷貝數(shù)目變異與乙肝的相關關系。總而言之，本研究闡明了中國漢族人群中CCL3L1基因在健康人群中的分布情況及與乙肝易感的相關關系，低拷貝數(shù)目者更易患慢性乙肝，而高拷貝數(shù)目有保護性作用，并對其可能的機制進行了初步的探討。

［1］Feuk L，Marshall CR，Wintle RF，et al.Structural variants:changing the landscape of chromosomes and design of disease studies［J］.Hum Mol Genet，2006，15(1):R57－ R66.

［2］Redon R，Ishikawa S，F(xiàn)itch KR，et al.Global variation in copy number in the human genome［J］.Nature，2006，444(7118):444－454.

［3］Skipper M.Human genomics:Structural variation catches up［J］.Nat Rev Genet，2009，10(11):740 －741.

［4］Bruce HA，Sachs N，Rudnicki DD，et al.Long tandem repeats as a form of genomic copy number variation:structure and length polymorphism of a chromosome 5p repeat in control and schizophrenia populations［J］.Psychiatr Genet，2009，19(2):64 －71.

［5］Sebat J，Lakshmi B，Malhotra D，et al.Strong association of de novo copy number mutations with autism［J］.Science，2007，316(5823):445－449.

［6］Townson JR，Barcellos LF，Nibbs RJ.Gene copy number regulates the production of the human chemokine CCL3－L1［J］.Eur J Immunol，2002，32(10):3016 －3026.

［7］Gonzalez E，Kulkarni H，Bolivar H，et al.The influence of CCL3L1 gene－containing segmental duplications on HIV － 1/AIDS susceptibility［J］.Science，2005，307(5714):1434－1440.

［8］Grunhage F，Nattermann J，Gressner OA，et al.Lower copy numbers of the chemokine CCL3L1 gene in patients with chronic hepatitis C［J］.J Hepatol，2010，52(2):153－159.

［9］Huik K，Sadam M，Karki T，et al.CCL3L1 copy number is a strong genetic determinant of HIV seropositivity in Caucasian intravenous drug users［J］.J Infect Dis，2010，201(5):730－739.

［10］中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會，肝病學分會.病毒性肝炎防治方案［J］.中華傳染病雜志，2001，19(1):56－62.

［11］Chen CJ，Yang HI，Iloeje UH，et al.Hepatitis B virus DNA levels and outcomes in chronic hepatitis B［J］.Hepatology，2009，49(5 Suppl):S72－S84.

［12］Kim WR，Benson JT，Therneau TM，et al.Changing epidemiology of hepatitis B in a U.S.community［J］.Hepatology，2004，39(3):811 －816.

［13］Thursz M.Pros and cons of genetic association studies in hepatitis B［J］.Hepatology，2004，40(2):284 －286.

［14］McKinney C，Merriman ME，Chapman PT，et al.Evidence for an influence of chemokine ligand 3－like 1(CCL3L1)gene copy number on susceptibility to rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2008，67(3):409 －413.

［15］Burns JC，Shimizu C，Gonzalez E，et al.Genetic variations in the receptor－ligand pair CCR5 and CCL3L1 are important determinants of susceptibility to Kawasaki disease［J］.J Infect Dis，2005，192(2):344 －349.

［16］Ptacek T，Li X，Kelley JM，et al.Copy number variants in genetic susceptibility and severity of systemic lupus erythematosus［J］.Cytogenet Genome Res，2008，123(1 －4):142－147.

［17］Mamtani M，Rovin B，Brey R，et al.CCL3L1 genecontaining segmental duplications and polymorphisms in CCR5 affect risk of systemic lupus erythaematosus［J］.Ann Rheum Dis，2008，67(8):1076－1083.