一種利用水提物快速簡便檢測煙草中TMV的方法

楊金廣，張 帥，申莉莉，錢玉梅，李 曉，王鳳龍*，段燕平，林北森，王 永，曹 娜

（1.煙草行業病蟲害監測與綜合治理重點實驗室，中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000；3.廣西壯族自治區煙草公司百色市公司，廣西 百色 533000；4.山東中煙工業有限責任公司，濟南 250100）

作為煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的代表種，煙草普通花葉病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）是一種分布廣泛的植物病毒，可侵染煙草和番茄以及其他茄科植物等300多種植物，具有廣泛的寄主范圍，為正單鏈RNA（+ssRNA）病毒。其基因組由6 395 nt組成[1]，至少編碼 4 個蛋白[2-4]，126 kDa 和183 kDa兩個蛋白編碼病毒的復制酶基因，是病毒復制所必需的，30 kDa的運動蛋白（movement protein,MP）控制著病毒胞間運動。17 kDa的外殼蛋白（coat protein,CP）是病毒的包裝衣殼，對病毒在寄主維管束組織的長距離運輸具有重要的作用。基因組 5′ 端和 3′ 端非編碼區（untranslated regions,UTRs）具有調控RNA復制和轉錄的功能，并對RNA的穩定也至關重要，具有RNA復制和合成起始的識別位點[4-7]。

TMV作為最早研究的病毒，其檢測體系已比較完善。常見的有電鏡檢測、血清學檢測和分子檢測（RT-PCR、real-time RT-PCR、PCR-ELISA 和Western-bloting），這些方法雖然對 TMV檢測具有高度的特異性和靈敏性，但均需要專門昂貴的設備儀器和試劑，并且耗時較長，例如血清學檢測一般需要12 h以上，而RT-PCR也需要6 h左右。本研究對感染TMV的煙草葉片的水提物進行了檢測，能夠穩定的檢測到與TMV相關的特異性條帶，為檢測煙草中的TMV侵染提供了更快捷、經濟的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

2008年采自中國農業科學院煙草研究所青島市即墨試驗基地呈典型煙草花葉病癥狀的煙草葉片，經枯三生煙草單斑分離后，保存在云煙 85植株上，經RT-PCR檢測確定為TMV，防蟲條件下，置于溫室中，在14 h光照和10 h黑暗的光周期下進行保存培養。

1.2 研究方法

1.2.1 煙草葉片水提物提取與檢測 取0.1 g新鮮的煙草葉片，置于100 μL無菌水中，研磨成勻漿，12 000 rpm，離心5 min，取上清液20 μL于1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，溴化乙錠染色后置于紫外凝膠成像系統（Pharmacia Biotech,Imagemaster VDS）采集圖像。

1.2.2 總RNA提取 取煙草TMV病葉0.05 g，于液氮中研磨成粉末狀，加入1 mL TRIzol reagent充分研磨，室溫放置5 min；加入氯仿200 μL，充分震蕩15 s，室溫放置5 min；12 000 rpm，4 ℃下離心 15 min；將上層水相轉入另一離心管中，加入0.5 mL異丙醇；12 000 rpm，4 ℃離心10 min（可見RNA沉淀），棄去上清；加入1 mL 70%乙醇（渦漩，7 000 rpm離心5 min）；干燥RNA沉淀，加ddH2O 20 μL溶解即可。

1.2.3 RT-PCR檢測 取提取后的總RNA 3 μL，利用M-MLVEasyscriptReverse Transcriptase試劑盒（北京全式金生物技術有限公司，北京）進行cDNA合成，具體方法均按照說明書進行操作。取 1 μL cDNA產物，利用用于PCR檢測反應，反應體系由10 μL 5×PCR buffer，2 μL dNTP mixture (2.5 mM)，正反向引物各 2 μL（10 μM）（CPF：5′-ATTAGACCCGCTAGTCACAGCAC-3′；CPR：5′-GTGGGGTTCGCCTGATTTT-3′）和 10 μL ddH2O組成，反應在50 μL的體積中進行反應。反應條件如下：第一步95 ℃，4 min；第二步95 ℃，15 s，62 ℃，35 s，共進行40個循環。PCR結束后，取 8 μL反應液在 1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，溴化乙錠染色后置于紫外凝膠成像系統（Pharmacia Biotech,Imagemaster VDS）采集圖像。

1.2.4 Northern-blotting分析 以TMV復制酶基因(accession number:AF395127; TMV-F:5′-GTTTCAGGATTCCCGTAC-3′; TMV-R:5′-ATCAGAAATATCGCCAGT-3′;)為靶基因，利用地高辛標記的 dUTP (DIG DNA Labeling and Detection Kit,Roche Applied Science)通過 RT-PCR合成一段600 bp的DNA探針。新鮮提取的TMV病葉水提物40 μL上樣于10%甲醛變性瓊脂糖凝膠進行電泳，然后通過電轉于硝酸纖維素膜上；然后65 ℃條件下，與探針反應16 h；2 × SSC和0.1%SDS于50 ℃條件下，洗滌2次，每次15 min；0.5× SSC和0.1% SDS于65 ℃條件下，洗滌2次，每次20 min；最后根據顯色試劑盒操作說明進行顯色反應（Roche Biochemicals）。

2 結 果

提取后的水提物經過 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果發現在TMV陽性植株中能夠穩定地檢測到6 000 bp左右的條帶，而在健康煙草葉片水提物中檢測不到任何電泳條帶（圖1）。為了進一步驗證結果的準確性與特異性，利用TMV特異性引物，對相同材料進行了RT-PCR檢測驗證，結果表明，在TMV陽性植株中能夠檢測到83 bp的片段，大小與預期相符（結果未顯示），而在健康煙草中，檢測不到任何條帶，說明該方法具有較高的特異性。為了進一步揭示水提物中的特異性電泳條帶，以TMV 復制酶基因為探針，通過Northern-blotting分析，結果顯示，水提物中電泳條帶與探針具有較強的雜交信號，而在健康煙株、PVY病株和CMV病株3種水提物中均檢測不到任何雜交信號（圖2），暗示該電泳條帶可能為TMV的基因組RNA。值得注意的是在該檢測體系中，水提物在常溫下非常不穩定，需要提取完畢后，立刻進行電泳檢測，在室溫條件下靜置 2 h，檢測的電泳條帶就變得非常微弱（圖1），而靜置3 h以上，就很難再檢測到任何電泳條帶（圖1）。

圖1 TMV煙草葉片水提物檢測結果Fig.1 The aqueous extract detection of tobacco leaves infected by TMV

圖2 不同煙草材料水提物的Northern-blotting分析Fig.2 Northern blot analysis of aqueous extract from TMV tobacco plant

3 討 論

在TMV煙草病葉中能夠檢測的6 000 bp左右的電泳條帶，推測該條帶可能為TMV基因組產物，因為TMV基因組大小為6 395 nt組成。同時，室溫條件下，水提物的不穩定性也暗示該條帶可能為RNA，因為 TMV為+ssRNA，RNA在沒有經過DEPC處理的環境中，及RNase存在的條件下，極易被RNase降解，而TMV也是+ssRNA病毒。因此，綜合兩方面推測在TMV病葉水提物中檢測到6 000 bp的電泳條帶可能為TMV基因組RNA。

李凡等曾利用水作為提取液來檢測煙草叢頂病毒，能夠檢測到與病害特異性 900 bp小分子RNA，但是單純的水提物穩定性差，重復性不好，為此研究者對方法進行了修改，對水提物重新進行了異丙醇或NaAC進行沉淀，然后利用75%的乙醇對沉淀進行洗滌，發現檢測結果非常穩定和特異。但在本研究中，利用李凡等的異丙醇和NaAC沉淀法，檢測結果并不理想，推測李凡等檢測的900 bp的小分子RNA可能為雙鏈RNA（dsRNA）[8]。而在本研究中檢測到 6 000 bp左右的條帶可能為+ssRNA，dsRNA較+ssRNA在常溫下更穩定。

同時該檢測方法還具有方便快速的特點，在常規檢測中耗時均較長，例如生物學檢測需要5～10 d才能檢測出來，并且易受周圍環境和寄主的影響，ELISA需要12 h左右，RT-PCR則需要3 h以上。而該方法只需15 min即可檢測到TMV的存在。同時較ELISA和RT-PCR更加經濟，不需要昂貴的儀器，僅需要一個電泳槽和紫外觀察裝置。

作為一種快速檢測的方法，也具有一定的局限性，就是在檢測過程中需要電泳裝置，這在實際生產中是很難進行推廣應用的。因此，生產中非常需要研究和開發更加方便快捷的檢測方法與工具，當前，在其他研究材料中常用的試紙條快速檢測是值得推薦的一種方法。

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