紅葡萄酒花色苷的研究

□西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 400715 陳穎秋 黃永俊 馬小星 鄧澤麗 洪 鐳

1 花色苷的概述

按照我國(guó)最新的葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)GB15037-2006規(guī)定，葡萄酒是以鮮葡萄汁為原料，經(jīng)全部或部分發(fā)酵釀制而成的，酒精度不低于7.0%的酒精飲品。紅葡萄酒顏色是非常重要的質(zhì)量指標(biāo)之一，紅葡萄酒色度的深淺不僅決定著葡萄酒的品質(zhì)，而且對(duì)葡萄酒感官質(zhì)量的影響很大。紅葡萄酒中的呈色物質(zhì)主要是花色苷，它是決定紅葡萄酒品質(zhì)和感官質(zhì)量的重要因素之一。花色素苷（Anthocyani）是苯并吡喃（peno-tyrilium）的衍生物，廣泛存在于絕大部分陸生植物的液泡中（除仙人掌、甜菜外），是水溶性黃酮類色素中最重要的一類，賦予水果、蔬菜、飲料制品等紅色、粉紅、藍(lán)色、紫色等五彩繽紛的顏色，特定條件下出現(xiàn)黑色。也就是說，花色素苷可帶來除綠色之外的所有顏色。花色苷賦予紅葡萄酒紅色，它在紅葡萄酒新酒中的含量為200～500 mg/L。

1.1 花色苷的結(jié)構(gòu)

花色苷由花色素和糖基構(gòu)成，屬黃酮類化合物，天然花色苷糖基基本結(jié)構(gòu)為3，5，7-三羥基-2-苯基苯并吡喃。花色素因3、5位上取代基差異而有不同種類。目前已知天然花色素有30余種，植物中常見的有6種：天竺葵色素（pelargonidin）、矢車菊色素（cynaidin）、飛燕草色素（delphinidin）、芍藥色素（peonidin）、牽牛花色素（petunidin）和錦葵色素（malvidin）。各種花色苷結(jié)構(gòu)上的差異是配糖體上羥基和甲氧基數(shù)目和位置，配糖體上結(jié)合的糖基數(shù)目、種類和位置、羥基乙酰化及與糖基相連脂肪酸種類與數(shù)目。這些差異決定了花色苷生物學(xué)性狀和功能的多樣性。

花色苷是花青素的糖苷，由一個(gè)花青素（花色苷元）與糖以糖苷鍵相連。花青素具有類黃酮典型的C6—C3—C6的碳骨架結(jié)構(gòu)。與花色素成苷的糖主要是葡萄糖、半乳糖、李糖、阿拉伯糖和由這些單糖構(gòu)成的均勻或不均勻的雙糖和三糖。自然界中最常見的花色素結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1

1.2 花色苷的性質(zhì)

花色苷為水溶性天然食用色素，花色苷和花色素的穩(wěn)定性均不高，花色苷的種類不同，其溶解度也有所不同，一般可溶于水和乙醇溶液，其顏色隨羥基（-OH）、甲氧基（-OCH3）、糖的結(jié)合位置及花色苷種類的數(shù)目不同而有所差別。影響花色苷穩(wěn)定性的主要因素有花色苷的結(jié)構(gòu)、pH值、氧濃度、氧化劑、親核試劑、酶、金屬離子、溫度和光照等。

1.2.1 pH值的影響：花色苷隨pH值的變化可出現(xiàn)4種結(jié)構(gòu)形式（如圖2所示），即藍(lán)色醌式結(jié)構(gòu)（A）、紅色2-苯基苯并吡喃陽離子（AH+）、無色醇型假堿（B）和無色查爾酮（C）。

每種平衡型的相對(duì)數(shù)量不僅和pH有關(guān)，還和特定的花色苷結(jié)構(gòu)有關(guān)。pH值不同的情況下，花色苷的形式發(fā)生變化，從而影響其呈色情況。在對(duì)其進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究表明：pH2時(shí)，吸光值最大（0.713），顏色為紫紅色；pH3時(shí)，溶液顏色變化不明顯，但色素吸光度值明顯降低；pH4時(shí)，溶液顏色明顯變淺；pH5～6時(shí)，溶液顏色更淺，吸光度值降為原來的50%左右；當(dāng)pH≥9時(shí)，花色素的特征顏色基本消失，呈藍(lán)綠或藍(lán)紫色。為了使色素溶液保持正常的顏色，應(yīng)該使溶液的pH值維持在2～3。

1.2.2 光照的影響：光照對(duì)花色苷具有兩種作用，一是有利于花色苷的生物合成，二是能引起花色苷的降解。在避光和室內(nèi)自然光下花色素變化很小，性質(zhì)表現(xiàn)穩(wěn)定，而在室外陽光下，花色素含量降到原來一半的時(shí)間（即半衰期）不到5h，色素溶液顏色明顯變淺。

1.2.3 溫度的影響：花色素苷受溫度的影響程度取決于受熱時(shí)間的長(zhǎng)短和溫度的高低。溫度越高，色素保持穩(wěn)定的時(shí)間越短，花色苷的顏色變化越快。110℃被認(rèn)為是花色苷分解的最高溫度。在60℃以下，花色苷的分解速度較低。花色素苷對(duì)巴氏消毒是穩(wěn)定的，對(duì)高溫（90℃）短時(shí)間（30min）熱處理也是穩(wěn)定的，顏色均無變化，但長(zhǎng)時(shí)間處于較高溫度下色素會(huì)發(fā)生褐變。

圖2

1.2.4 金屬離子的影響：花色苷與Al3+、Fe2+、Fe3+、Sn2+、Ca2+ 等可以發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，從而對(duì)花色苷的顏色起到穩(wěn)定作用。Zn2+、Ca2+濃度在小于0.02g/mL時(shí)，對(duì)花色素影響不顯著，顏色變化不明顯。在B一環(huán)上含有鄰位羥基的花色苷能與金屬離子絡(luò)合。Fe3+對(duì)色素有強(qiáng)烈的破壞作用，使色素很快變?yōu)槌赛S色并有沉淀生成。Fe3+離子的各濃度間對(duì)花色素穩(wěn)定性不良影響差異極顯著，濃度越高影響越大，花色素最大降幅約30%，溶液顏色變成淺紅褐色。光譜分析發(fā)現(xiàn)Fe3+使色素的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，最大吸收峰消失。因此，紅酒應(yīng)避免接觸鐵器，包裝需用鋁箔袋、玻璃瓶等。雖然金屬離子對(duì)花色苷具有穩(wěn)定和保護(hù)作用，但其效應(yīng)也不是有益無害的，因?yàn)樵谠錾耐瑫r(shí)形成的金屬——單寧絡(luò)合物可導(dǎo)致褪色。

1.2.5 氧氣、水分活度的影響：在分子氧存在的條件下，花色苷會(huì)降解生成無色的或褐色的物質(zhì)，這是由于花色素高度的不飽和結(jié)構(gòu)和其對(duì)氧氣頗為敏感所致。水分活度對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響機(jī)理還不明確，但是已經(jīng)證實(shí)，在水分活度0.63～0.79 范圍內(nèi) ，花色苷的穩(wěn)定性相對(duì)最高。

1.2.6 維生素C的影響：在含有維生素C和花色苷的果汁中，這兩種物質(zhì)的含量會(huì)同步減少。維生素C在氧化中可以產(chǎn)生 H2O2，對(duì) 2- 苯基苯并吡喃陽離子的2位碳進(jìn)行親核進(jìn)攻，從而產(chǎn)生無色的酯和香豆素等衍生物，進(jìn)一步的降解或聚合，最終在果汁中產(chǎn)生褐色沉淀物。有實(shí)驗(yàn)表明：在室內(nèi)自然光下，維生素C含量小于1.0g/mL時(shí)，對(duì)花色素的含量影響不大。

1.2.7 輔色劑的影響：輔色劑的主要作用是使幾乎所有的花色素苷在適宜的條件下產(chǎn)生紅移并增加最大吸收波長(zhǎng)的吸光度。輔色作用受pH值、輔色劑和色素的種類及濃度的影響。輔色劑主要是黃酮類化合物、氨基酸、核苷酸，花色素苷自身也可以成為輔色素。

1.2.8 酶的影響：葡萄組織中的酶可以破壞葡萄與葡萄酒中花色素苷，在花色苷降解過程中，涉及到的酶有糖苷酶和多酚氧化酶這兩大類。糖苷酶可水解花色苷得到游離的糖和花色素，花色素很不穩(wěn)定，可自發(fā)轉(zhuǎn)換成無色的物質(zhì)。多酚氧化酶作用于存在鄰二酚羥基的花色苷，產(chǎn)生的中間產(chǎn)物——鄰醌能通過化學(xué)氧化作用使花色苷轉(zhuǎn)化為氧化的花色苷及降解產(chǎn)物。

1.2.9 SO2的影響。二氧化硫是食品工業(yè)中常用的防腐劑和漂白劑。二氧化硫?qū)ㄉ盏钠卓赡芸赡婊虿豢赡妗．?dāng)二氧化硫用量在500～2 000ug/g時(shí)，這種漂白是可逆的，在后續(xù)的加工中，通過大量水洗脫后，顏色可部分恢復(fù)。對(duì)不可逆漂白的反應(yīng)研究較多，認(rèn)為二氧化硫在果汁的酸作用下形成亞硫酸氫根，它對(duì)花色苷4一位碳親核攻擊生成了無色的花色苷亞硫酸鹽復(fù)合物。

1.3 花色苷的生理功能

1.3.1 抗氧化活性：花色苷具有極強(qiáng)抗氧化作用，且抗氧化強(qiáng)弱與其結(jié)構(gòu)有關(guān):苷元母核B環(huán)上3’4’鄰二酚羥基有很強(qiáng)的供氫能力，可捕獲自由基，抗氧化性最好；此外A環(huán)上5、7、8位增加羥基可不同程度增加抗氧化能力。研究結(jié)果提示，原花青素是良好的天然抗氧化劑，通過清除體內(nèi)過多的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，維持體內(nèi)自由基和抗氧化酶之間的平衡，與體內(nèi)各種抗氧化酶共同維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，從而預(yù)防由于自由基或脂質(zhì)過氧化造成的各種疾病，發(fā)揮抗疲勞、抗輻射損傷、抗衰老等作用。

1.3.2 抗突變、抗癌：孫志廣等從遺傳學(xué)和生化毒理學(xué)角度研究了葡萄提取物的抗誘變作用及機(jī)理。通過微核試驗(yàn)和小鼠肝組織中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性、還原型谷胱甘肽（GSH）含量的測(cè)定，表明花青素對(duì)環(huán)磷酰胺（CPA）誘發(fā)的小鼠骨髓多染紅細(xì)胞（PCEs）微核細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，并能提高肝臟GST活性，升高GSH含量，說明花青素對(duì)化學(xué)誘變劑引起的染色體斷裂有一定保護(hù)作用。一些研究發(fā)現(xiàn)花色苷具有抗癌作用，有些甚至在微摩爾量劑量就可在體外抑制人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。可抑制體外人陰道癌細(xì)胞株A431的生長(zhǎng)。花色苷抑制腫瘤的機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生有關(guān)。

1.3.3 保護(hù)心血管及神經(jīng)系統(tǒng)：張小郁等用胰蛋白酶（DOG）、阿霉素（ADR）、黃嘌呤氧化酶（X-XO）造成損傷模型，比色法測(cè)定培養(yǎng)液中LDH的活性。結(jié)果表明，葡萄中原花青素對(duì)心肌細(xì)胞損傷有一定保護(hù)作用。另外，花色苷可抵抗組胺等誘導(dǎo)的動(dòng)脈收縮和抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性，降低和維持正常血壓。

1.3.4 改善視力：通過給兔子靜脈注射花青苷、花翠素、甲花翠素及錦葵花素的配糖體，在暗黑下的適應(yīng)初期可促進(jìn)兔子視紫質(zhì)的再合成，于是推測(cè)花色苷對(duì)視紫質(zhì)的再合成體系具有活化作用，從而具有提高視力的功能。而在適應(yīng)末期，視網(wǎng)膜中的視紫質(zhì)的量比對(duì)照兔子要高得多。

1.3.5 其他功效：花色苷具有多種生理功效，如花色苷能通過防止應(yīng)激反應(yīng)和吸煙引起的血小板凝集來減少心臟病和中風(fēng)的發(fā)生；具有抗炎功效，因而可以預(yù)防包括關(guān)節(jié)炎和腫脹在內(nèi)的炎癥；可以緩解花粉病和其他過敏癥；防止腎臟釋放出的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶所造成的血壓升高（另一個(gè)降血壓功效）；作為保護(hù)腦細(xì)胞的一道屏障，防止淀粉樣β蛋白的形成、谷氨酸鹽的毒性和自由基的攻擊，從而預(yù)防阿爾茨海默氏病；通過對(duì)彈性蛋白酶和膠原蛋白酶的抑制使皮膚變得光滑而富有彈性，從內(nèi)部和外部同時(shí)防止由于過度日曬所導(dǎo)致的皮膚損傷等等。

1.4 葡萄酒花色苷的研究現(xiàn)狀

目前對(duì)葡萄與葡萄酒中花色素苷的研究，主要集中在葡萄與葡萄酒中花色素苷的醫(yī)療保健作用和機(jī)理；組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)天然花色素苷的研究；葡萄中花色素苷的種類、含量、變化規(guī)律和影響其含量的因素；花色素苷的生物合成途徑、合成花色素苷的基因和酶的研究；葡萄酒中花色素苷的種類、含量、變化規(guī)律和機(jī)理；花色素苷的理化性質(zhì)、花色素苷的提取純化和分析；葡萄與葡萄酒中花色素苷的應(yīng)用研究等方面。

2 葡萄酒中花色苷的測(cè)定

2.1 高效液相色譜（HPLC）

HPLC可以高效分離、檢測(cè)、定性和定量分析葡萄與葡萄酒中的花色素苷，對(duì)樣品處理少，不需衍生化。J.Bakker等比較了HPLC和光譜法測(cè)定花色素苷的差異，認(rèn)為：HPLC可以真實(shí)地測(cè)定紅葡萄酒中游離的花色素苷含量，而光譜法得到的結(jié)果則偏高。與HPLC-MS相比，HPLC更加普及，成本更加低廉。目前，HPLC仍然是測(cè)定葡萄與葡萄酒花色素苷最常用的方法。

2.2 光譜定量分析方法

pH示差法中，為使pH示差法有較好的靈敏度及準(zhǔn)確性，pH的選定對(duì)花色素苷的定量分析具有重要的意義。在此兩個(gè)pH處測(cè)定的花色素苷的吸光值差異應(yīng)是最顯著的；單一pH的輕微變動(dòng)，對(duì)花色素苷吸光值的影響是極小的；花色素苷在所處的兩個(gè)pH下，應(yīng)是相當(dāng)穩(wěn)定的。

花色苷的含量：（mg/100g）=（△ODpH1.0-pH4.5×DV×VF）/（avE1%1cm×W×10）

△ODpH1.0-pH4.5：花色素苷溶液在pH=10和pH=4.5之間的吸光度之差

DV：稀釋體積VF：稀釋倍數(shù)W：樣品重量avE1%1cm：平均消光系數(shù)

2.3 亞硫酸脫色法

利用花色素可與酸性亞硫酸根離子結(jié)合成無色絡(luò)合物的性質(zhì)，在添加過量的酸性亞硫酸鹽之后，酒的顏色發(fā)生變化。這種變化是和花色素苷含量成正比例發(fā)展的。從色度的高低可以求出花色素苷含量的多少。

2.4 毛細(xì)血管電泳（CE）

毛細(xì)血管電泳也可以用來分析花色素苷（包括游離和聚合），它具有靈敏度高、分辨率高、樣品消耗少和溶劑需要量少等特點(diǎn)。RubenSaenz-Lopez等（2004）用毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）分析了酒齡在1～14年的紅葡萄酒，根據(jù)不同的遷移順序判斷花色苷種類。CZE可以測(cè)定葡萄酒中的聚合色素，不像HPLC，CZE可以很容易地分離聚合色素，具有比HPLC更短的保留時(shí)間，更少的溶劑消耗量，更高的分離效率，更低的成本。但是CZE的靈敏度不優(yōu)于HPLC，而且也達(dá)不到HPLC分離復(fù)雜化合物的范圍。

2.5 質(zhì)譜法

質(zhì)譜是物理分析方法，在一定條件下，可以給出復(fù)雜有機(jī)物的確定的重復(fù)的質(zhì)譜圖。質(zhì)譜可以給出花色素苷的分子離子峰、其相應(yīng)的糖苷配基碎片峰和糖碎片峰。JohannaBakker和ColifF.Timberlake在分析葡萄酒花色素苷時(shí)，采用 FAB（FastAtomBombardment），用氙氣轟擊樣品使之離子化，給出分子離子峰等相關(guān)數(shù)據(jù)，這種方法適用于分析極性大分子量的化合物。此外，還有電子轟擊質(zhì)譜（LC-EI-MS）和激光解吸/電離質(zhì)譜（MALDI-MS），這些都適用于高極性、熱穩(wěn)定性差、難揮發(fā)葡萄酒中的花色苷。

3 展望

在鑒別葡萄酒真假的眾多研究方法中，需要精密的儀器太多，需要的方法太復(fù)雜，所以建立一套以葡萄原料所含天然特性成分花色苷的性質(zhì)為依據(jù)的、簡(jiǎn)單易行的全汁和非全汁葡萄酒的鑒定方法，更多的了解花色苷的性質(zhì)、功能等，具有重要的理論意義。若利用葡萄酒中的呈色物質(zhì)花色苷在不同的pH值環(huán)境中顯色作用不同，即隨pH值改變而發(fā)生可逆性結(jié)構(gòu)變化和顏色變化的原理制定出的簡(jiǎn)單易行的鑒定方法，待技術(shù)成熟之后，此研究的實(shí)際意義和經(jīng)濟(jì)意義非常巨大。

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