雷帕霉素對胰腺癌PC-2細胞增殖和凋亡的影響

劉小旭，劉夢潔，代志軍※，王西京，康華峰

(1.西安交通大學醫學院第二附屬醫院腫瘤科，西安710004;2.西安交通大學醫學院，西安710061)

胰腺癌的發病在世界范圍內迅速增加，其惡性程度高、轉移早、治療困難、預后差，是腫瘤學界的一大難題。近年來，靶向治療因其特異性強、靶向抑制作用和不良反應輕微，在腫瘤治療中占有重要地位。分子靶向藥物可通過阻斷腫瘤細胞的信號轉導，從而控制細胞基因表達的改變，產生抑制腫瘤細胞生長的效應。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路是與細胞增殖和細胞凋亡關系最為密切的信號轉導通路之一［1］。作為mTOR抑制劑，雷帕霉素(rapamycin，RPM)在腫瘤分子靶向治療中受到了越來越多的關注。本研究以體外培養的人胰腺癌PC-2細胞為對象，探討RPM對胰腺癌細胞增殖和細胞凋亡的影響及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料 胰腺癌PC-2細胞株由西安交通大學管海濤博士惠贈。新生牛血清(Gibco，USA);RPMI1640 培養基(Gibco，USA);碘化丙啶 (propidiumiodide，PI)(Sigma，USA);四甲基偶氮唑鹽(Sigma，USA);熒光探針羅丹明123(Rhodamine 123)(Sigma，USA);RPM(Sigma，USA);其他試劑均為國產分析純。流式細胞儀(Becon Dickinson Facsalibur公司，USA)。

1.2 細胞培養和傳代PC-2細胞于37℃、5%CO2混合氣體和飽和濕度的培養箱中進行培養，生長培養基為RPMI 1640完全培養基，含10%熱滅活(56℃，30 min)的小牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL，待細胞生長呈單層鋪滿瓶底時，用0.25%的胰蛋白酶∶0.02%乙二胺四乙酸=1∶1的混合消化液消化傳代。細胞換液時間為2 d，傳代5 d。

1.3 細胞增殖能力檢測 選取對數生長期的PC-2細胞，經胰酶消化、臺盼藍染色后在紅細胞計數板上計數，確?；罴毎?7%以上。調整細胞濃度為每孔5×103個(每孔100 μL)，加到96孔培養板中。將培養板放入37℃、5%CO2孵箱中培養。另設對照組。待細胞貼壁后取出培養板，分別加入適量RPM，使終濃度分別為 10、20、30、40 和50 nmol/L，每個濃度設5個復孔;同時設置未加RPM者為空白對照組和調零孔。培養板放回孵箱繼續培養6 h，取出培養板，每孔加入四甲基偶氮唑鹽5 μg/μL，培養板再放回孵箱孵育4 h。吸出上清液，加入200 μL二甲基亞砜。在平板搖床搖10 min，用酶標儀測490 nm波長處每孔的吸光度(A值)。細胞生長抑制率(IR%)=［(對照組 A值 －處理組 A值)/對照組 A值］×100%

1.4 細胞凋亡檢測 取處于對數生長期的細胞，常規消化，制成單細胞懸液。計數并均以105個/mL濃度接種于6個50 cm培養瓶中，分別加入適量RPM，使終濃度分別為10、20、30、40 和 50 nmol/L，常規培養48 h后，消化并收集細胞，制成單細胞懸液，將細胞懸液加入離心管中，800 r/min離心5 min，棄掉離心管中上清;以冰PBS緩沖液漂洗兩遍，沿管壁緩慢加入75%的4℃乙醇固定，4℃過夜;測試前用PBS液洗去乙醇，離心除去上清，每管加入100 μg/mL RNA酶1 mL，置于37℃孵箱中30 min;然后每管中加入125 μg/mL碘化丙啶1 mL標記，低溫(2～8℃)避光靜置30 min，上流式細胞儀進行檢測分析。

1.5 mTOR mRNA表達檢測 PC-2細胞按1×106個/瓶接種于100 mL培養瓶中，孵育24 h待細胞貼壁后加 RPM。RPM 按 0、10、20、30、40 和 50 nmol/L濃度梯度分別處理12 h，收集細胞，用Trizol提取總RNA。取1 μg RNA經反轉錄酶在下列條件下合成cDNA:70℃ 5 min，42℃ 延伸 60 min，95℃ 酶滅活3 min，4℃終止反應。然后用該cDNA作為模板進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)，PCR引物由 Invitrogen公司合成。mTOR引物序列:5'-CGCTGTCATCCCTTTATCG-3'(sense)和5'-ATGCTCAAACACCTCCACC-3'(anti-sense)，擴增片段為218 bp，退火溫度為55℃(35個循環)。內對照β肌動蛋白(β-actin)引物序列:5'-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'(sense)，5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'(anti-sense)，擴增片段為136 bp，退火溫度為55℃(40個循環)。擴增條件如下:95℃預變性3 min，95℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，進行相應循環次數。PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，50 mL瓊脂糖中加溴乙錠2.0 μL凝膠成像系統作密度指數分析。β-actin擴增產物為內參照。mTOR mRNA相對表達量的判定:以各mTOR mRNA電泳條帶密度指數與相對的內參照β-actin密度指數之比來表示。

1.6 統計學方法 應用SPSS 11.0統計軟件進行處理，計量數據以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用方差分析法，相關性分析采用Spearman法，顯著性檢驗水平為α=0.05。

2 結果

2.1 RPM對PC-2細胞增殖的影響 不同濃度的RPM作用于 PC-2細胞0、24、48和72 h后，對 PC-2細胞的生長有明顯的抑制作用，呈時間和濃度的依賴性，隨藥物作用時間延長和濃度增加，細胞生長抑制率逐漸升高，50 nmol/L的RPM作用96 h引起的生長抑制率明顯高于其他濃度組的抑制率(P ＜0.05)，高達(82.5 ±5.4)%(圖1)。

圖1 RPM對PC-2細胞增殖的抑制作用

2.2 RPM對PC-2細胞凋亡的影響 正常對照組PC-2細胞凋亡率為(3.27 ±1.43)%;10～50 nmol/L RPM組作用24 h后PC-2細胞凋亡率分別為(8.53±2.14)%、(17.58 ± 4.10)%、(39.24 ±5.66)%、(51.30 ±4.12)% 和(64.81 ±7.52)%，結果顯示10～50 nmol/L RPM均能誘導不同程度的細胞凋亡(P ＜0.05或P ＜0.01);且10～30 nmol/L RPM 組以早期凋亡細胞為主，隨著RPM濃度的增高，晚期凋亡細胞明顯增多(圖2)。

圖2 RPM誘導PC-2細胞凋亡的AnnexinV-FITC/PI雙標染色及流式細胞術分析

2.3 RPM對胰腺癌PC-2細胞mTOR mRNA表達的影響 反轉錄-PCR結果顯示，未經RPM處理的PC-2細胞中mTOR mRNA水平較高，其中空白對照組、10～50 nmol/L RPM組mTOR mRNA相對表達量分別為:127.35 ± 7.52、104.31 ± 6.31、96.52 ± 4.24、53.60 ±5.13、50.09 ±4.12、21.43 ±2.42。與空白對照組相比，藥物處理組mRNA相對表達量均有不同程度的抑制效應;而且隨著RPM濃度增高，mTOR mRNA水平表達逐漸降低(圖3A，圖3B)。RPM與mTOR mRNA表達間呈現較好的劑量依賴性關系(P ＜0.05)。

圖3A 不同濃度的RPM處理12 h后PC-2細胞中mTOR mRNA的表達

圖3B 不同濃度的RPM處理12 h后PC-2細胞中mTOR mRNA的表達

3 討論

mTOR是一種進化非常保守的蛋白激酶，廣泛地存在于多種生物細胞中。近年來的進一步研究發現，mTOR在細胞蛋白質合成、能量平衡中起關鍵作用，從而影響細胞生長和增殖的很多方面，包括細胞分化、細胞周期進程、新生血管生成、蛋白降解和細胞凋亡等。mTOR可被許多致瘤信號所激活，例如，表皮生長因子、胰島素樣生長因子和血管內皮生長因子等生長因子受體的活化或突變、PTEN抑癌基因的沉默、磷脂酰肌醇3激酶催化亞型的激活、Akt基因的擴增以及Ras-Raf-MEK通路的激活［1］。

RPM是一種親脂性三烯含氮大環內酯抗生素類免疫抑制藥，是最早被發現的mTOR抑制劑。RPM通過調節mTOR通路從而抑制乳腺癌細胞增殖，同時也可以抑制宿主免疫應答［2］。現主要用于防治腎、肝等器官移植的排斥反應［3］。其主要不良反應為高血脂和骨髓抑制作用，長期應用耐受良好。以往的研究證實，RPM具有濃度依賴性地抑制腫瘤細胞生長的活性，例如肉瘤、膀胱癌、肝癌等［4-6］。本實驗中不同濃度的RPM作用于PC-2細胞0～96 h后，對PC-2細胞的生長有明顯的抑制作用，表現為呈時間和濃度的依賴性，隨藥物作用時間延長和濃度增加，細胞生長抑制效應逐漸增強。

mTOR抑制劑是否能誘導腫瘤細胞凋亡，目前尚有爭議。在胰腺癌中，mTOR抑制劑可抑制幾乎所有p53缺陷的癌細胞株的生長［7］。研究發現，RPM誘導凋亡的能力可能依賴于細胞內p53的水平［8］。在缺乏功能性p53的橫紋肌肉瘤中，RPM抑制細胞生長，誘導大量細胞凋亡;但功能性p53的表達則保護肉瘤細胞逃逸RPM誘導的凋亡。對于高表達Akt的淋巴瘤，mTOR抑制劑能顯著增加化療誘導的凋亡［9］。Huang 等［10］的研究揭示，RPM 不僅能引起腫瘤細胞周期阻滯，還可誘導p53功能缺失所致的細胞凋亡。其可能機制為RPM能夠誘導凋亡信號調節酶1激活，并可延遲其激活時間，同時也能夠激活C-Jun N端酶的活性，提高磷酸化的C-Jun的含量，凋亡信號調節酶1和磷酸化的C-Jun都能夠促進腫瘤細胞的凋亡，從而抑制腫瘤的生長［11］。Fechner等［12］的研究中可抑制人膀胱癌細胞的增殖但不能有效地誘導細胞凋亡，同時發現RPM可減少缺氧導致的血管內皮生長因子合成。本研究中流式細胞術分析結果發現RPM具有誘導PC-2細胞凋亡的作用，且隨著藥物濃度的提高，凋亡率增高，存在一定的劑量依賴關系。流式細胞術檢測結果顯示:正常對照組、10～50 nmol/L RPM組PC-2細胞凋亡率分別為(3.27 ± 1.43)%、(8.53 ± 2.14)%、(17.58 ±4.10)%、(39.24 ±5.66)%、(51.30 ±4.12)% 和(64.81 ±7.52)%，提示10～50 nmol/L RPM 均能誘導不同程度的細胞凋亡(P＜0.05或 P＜0.01);且10～30 nmol/L RPM組以早期凋亡細胞為主，隨著RPM濃度的增高，晚期凋亡細胞明顯增多。

RT-PCR結果顯示，與空白對照組相比，RPM處理組mRNA相對表達量均有不同程度的抑制效應;而且隨著RPM濃度增高，mTOR mRNA水平表達逐漸降低(圖3A、3B)。RPM與mTOR mRNA表達間表現出較好的劑量依賴性關系(P＜0.05)。

綜上所述，RPM可有效抑制胰腺癌PC-2細胞增殖，并誘導細胞凋亡，其作用機制可能與下調mTOR基因表達有關。

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