聯合應用sIL-5Rα及 sIL-13Rα2對哮喘小鼠IgE、INF-γ水平的影響

楊學敏 史海廣 成家軍 李志奎

哮喘是一種由多種炎癥介質、炎癥細胞和細胞因子參與的氣道慢性炎癥疾病，近年來發病率急劇增加，給人們的健康帶來極大危害［1］，因此迫切需要新的治療方法。哮喘發病機制復雜多樣，目前認為Th1/Th2反應失衡導致Th1功能相對抑制，Th2功能相對亢進是其重要的發病機制之一。Th1分泌的INF-γ在細胞內具有吞噬微生物的功能，并與Th2產生的IL-4具有對抗作用。而IL-4、IL-5、IL-13是經典的Th2細胞因子，參與B細胞分化、促使IgE分泌增加、嗜酸性粒細胞活化和聚集、黏液分泌增加及氣道高反應性，在哮喘發病中起到重要的作用，因此IL-5、IL-13成為新的哮喘治療靶點。本實驗聯合應用sIL-5Rα及sIL-13Rα2治療哮喘小鼠，觀察其支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)及血清中 IgE、INF-γ 水平變化。

材料與方法

一、實驗材料

1.動物:6～8周齡BALB/c小鼠50只，雌性，體重(22±3)g，來源于第四軍醫大學實驗動物中心，非含卵蛋白飼料喂養，飼養環境為溫度23±2℃，濕度(55.5±10%)。

2.藥物和試劑:卵白蛋白(OVA)(美國Sigma公司)，氫氧化鋁(Al(OH)3)，生理鹽水，sIL-5Rα、IL-13 sR α2(本課題組實驗合成)，ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

3.主要儀器:402型超聲霧化器(上海四菱醫療器械廠)，美國BeckmanJ 2型低溫高速離心機，酶標儀型(Thermo公司)。

二、實驗方法

1.實驗動物分組:實驗小鼠隨機分為5組，每組10只，即正常組、哮喘組、sIL-5Rα治療組、sIL-13Rα2治療組及聯合治療組。

2.哮喘模型制備及干預:各組小鼠(正常對照組除外)分別于第0、7、14天腹腔注射20 μg OVA和20 mg氫氧化鋁凝膠0.9%氯化鈉混合液200 μl致敏，正常對照組腹腔注射相同體積0.9%氯化鈉溶液。第21～27天將小鼠(正常組除外)置于封閉容器中，超聲霧化吸入5%OVA生理鹽水誘發哮喘，每天誘發1次，每次30 min，其中sIL-5Rα治療組、sIL-13Rα2治療組及聯合治療組分別于誘發前30 min給予腹腔注射100 μg sIL-5Rα、sIL-13Rα2及聯合應用sIL-5Rα及sIL-13Rα2各100 μg，正常組和哮喘組激發前30 min給予腹腔注射相同體積生理鹽水，共7 d，正常組用生理鹽水代替OVA進行激發。

3.樣本采集:末次激發24 h后，經小鼠眼球取血，靜置1 h后，3000 r/min離心15 min留取血清，將血清置于-20℃冰箱中保存備用。小鼠氣管插管，Hanks液0.5 ml灌洗，回收灌洗液，重復3次，1500 r/min離心10 min，收集上清液，-20℃冷凍保存備用。

4.細胞因子的測定:采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法，檢測血清及BALF中IgE、INF-γ水平，操作嚴格按照說明書進行。

三、統計學處理

結 果

一、癥狀觀察

哮喘組小鼠逐漸出現煩躁不安、抓鼻、抓臉、呼吸加深加快、腹肌抽搐、大小便失禁、哮鳴音等陽性反映，提示哮喘模型建立成功。sIL-5Rα治療組、sIL-13Rα2治療組小鼠可見輕度煩躁不安、呼吸加快、腹肌抽搐等反應，提示治療有效。聯合治療組與正常組癥狀上基本無差異，未見上述癥狀，提示聯合治療效果更佳。

二、對IgE及INF-γ水平的影響

試驗中各組小鼠BALF及血清中IgE、INF-γ水平變化如表1所示。與正常組比較，哮喘組BALF及血清中IgE均明顯增高，INF-γ均明顯下降(P＜0.01);與哮喘組比較，sIL-5Rα治療組、sIL-13Rα2治療組及聯合治療組IgE亦明顯降低，INF-γ明顯增高(P＜0.01);與sIL-5Rα治療組及sIL-13Rα2治療組比較，聯合治療組IgE均亦明顯下降，INF-γ明顯增高(P＜0.01)。

討 論

哮喘是一種以嗜酸性粒細胞聚集、杯狀細胞過度增生、黏液分泌增加以及氣道高反應性為主要特征的慢性炎癥性疾病，主要是Th2細胞因子IL-4，IL-5，IL-13產生增多，而Th1細胞因子IFN-γ產生減少，從而導致B細胞合成增多，嗜酸性粒細胞活化浸潤氣道造成的氣道高反應性［2］。嗜酸性粒細胞是過敏性及內源性哮喘的標志物，是過敏性哮喘主要的效應細胞［3］。IL-13可活化嗜酸性粒細胞，延長其存活時間并呈濃度梯度依賴關系;同時IL-5也是重要的嗜酸性粒細胞趨化物質，IL-13與IL-5在活化嗜酸性粒細胞中具有協同刺激作用。嗜酸性粒細胞還可以釋放細胞因子IL-3和IL-5，引起進一步的嗜酸性粒細胞產生和移行，并且合成和釋放脂質介質。以往的研究中發現sIL-5Rα、sIL-13Rα2可有效降低哮喘小鼠血清中IL-5、IL-13水平，從而抑制嗜酸性粒細胞的增加，達到緩解哮喘氣道高反應性等哮喘癥狀［4］。從本實驗癥狀觀察上也可說明這一點。

研究發現:IgE是介導Ⅰ型超敏反應的重要介質，當機體接觸過敏原時，IgE交聯導致肥大細胞和嗜酸性粒細胞脫顆粒釋放炎癥介質引起強烈的、以嗜酸性粒細胞浸潤為主的局部炎癥反應。這種炎癥反應是哮喘的生理學和臨床表現的物質基礎，表現為氣道高反應性和發作性的咳嗽、喘息、胸悶的等癥狀。IL-4、IL-13具有免疫調節作用，可促進B細胞增值分化、提高B細胞活性和直接誘導B細胞合成過多IgE［5］。而IL-5在IL-4依賴的IgG1分泌性細胞中具有引導作用，與其在B-2細胞分化中有協同作用，與IL-4的表達存在相關關系［6］。IL-5能協同IL-4促進B細胞生成IgE。當IL-5與IL-4同用于刺激B細胞時，合成IgE的能力可比單用IL-4時增加9～14倍，因此，IL-5在IgE介導的Ⅰ型過敏反應中具有重要的作用。本研究中聯合治療組BALF及血清中IgE水平明顯降低，并且與哮喘組、sIL-5Rα治療組及sIL-13Rα2治療組比較均有顯著性差異。其機制可能是由于聯合治療組通過抑制IL-5、IL-13細胞因子水平，并且使Th1/Th2細胞比例失衡向正常方向發展，提高IFN-γ的水平，干預IgE的產生。

表1 各組小鼠BALF及血清中IgE、INF-γ水平變化(，n=10)Table 1 The changes of IgE，INF-γ in BALF and serum in mice(，n=10)

表1 各組小鼠BALF及血清中IgE、INF-γ水平變化(，n=10)Table 1 The changes of IgE，INF-γ in BALF and serum in mice(，n=10)

注:與正常對照組比，aP ＜0.01;與哮喘組比，bP ＜0.01;與聯合治療組比，cP ＜0.01

研究證實:IFN-γ主要由活化的CD4+Th1細胞分泌，IFN-γ增加細胞表面MHC分子、細胞因子的產生和巨噬細胞活性，使免疫反應增強，抑制Th0向Th2分化，抑制IL-4、IL-5、IL-l3等細胞因子產生，進而抑制IgE產生和EOS活性，是哮喘免疫調節中的一個十分重要的抑制因子，許多細胞因子均通過它而發揮生物作用［7］。另外IFN-γ還能顯著抑制成纖維細胞的增生及膠原的合成，促進成纖維細胞的凋亡及受損肺泡上皮的修復，并抑制轉化生長因子-β的表達［8］。免疫失調是哮喘的重要發病機制，哮喘發作時體內Th1/Th2細胞比例失衡，Th1細胞合成減少，導致其分泌的IFN-γ相對減少，此為哮喘的重要發病機制之一。本研究結果顯示聯合治療組BALF及血清中IFN-γ水平明顯高于哮喘組、sIL-5Rα治療組及sIL-13Rα2治療組。其機制可能是由于常態時Th1/Th2細胞之間處于相互抑制狀態，而在哮喘小鼠中Th2細胞占優勢，抑制了Th1細胞分泌，導致其分泌的IFN-γ減少［9］。而聯合治療組通過抑制IL-5、IL-13細胞因子的合成，使Th2優勢狀態向Th1優勢發展，Th1分泌增加，從而使IFN-γ合成增減加。

本研究結果表明，聯合應用sIL-5Rα及sIL-13Rα2治療哮喘小鼠可顯著降低BALF及血清中IgE含量及升高IFN-γ含量，從而改善和緩解哮喘癥狀，較單獨治療效果更明顯，其有望成為哮喘治療又一條有效途徑。

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