東北黑木耳栽培菌株的酯酶同工酶分析*

韓增華，高 娃，張丕奇，劉佳寧，戴肖東

（黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010）

同工酶是催化功能相同而酶蛋白的分子構型不同的酶類，同工酶結構的相似性反映了生物間的親緣關系，因此同工酶譜資料可作為鑒定物種，研究分類、進化、遺傳與變異的重要指標。近十年來在真菌的分類鑒定研究中的應用日益增多，其中用于食、藥用真菌的品種分類鑒定的同工酶主要以酯酶同工酶為主［1-3］。在黑木耳的菌株鑒別，親緣關系分析、多樣性等研究中也以酯酶同工酶研究比較多［4-6］。目前，未見有關東北主栽黑木耳菌株酯酶同工酶酶譜系統分析的報道。本文選用生產菌種為材料，研究東北地區常用栽培菌株的酯酶同工酶酶譜多樣性，通過分析，旨在為菌種的良種選育、種性鑒定及菌種管理等工作提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共25個，詳見表1

表1 供試黑木耳菌株Table 1 Strains of Auricularia auricular tested in the study

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基

母種培養基、親和性實驗用培養基（cPDA）：土豆200g煮1000 m L汁，瓊脂粉14.0g，葡萄糖20.0g，磷酸二氫鉀3.0g，硫酸鎂1.5g，蛋白胨0.5g，維生素B110.0m g，pH自然。菌絲形態觀察用培養基（PDA）：土豆200g煮1000 m L汁，瓊脂粉14.0g，葡萄糖20.0 g。同工酶制備液體培養基：元蔥200g煮1000 m L汁，蔗糖10g，阿魏酸0.06g，pH值自然。

1.2.2 菌絲形態分類

將被試菌株分別接種于直徑為88m m盛有PDA平皿中，接種邊長為2 m m正方形菌塊，25℃下恒溫培養，并于接種后的第十天觀察菌絲形態。

1.2.3 親和性實驗

被試菌株兩兩配對，分別接種于直徑為88m m盛有cPDA平皿中，接種邊長為2m m正方形菌塊，每兩個品種接種間距為25 m m，25℃下恒溫培養，15d后觀察不同菌株菌絲相交區域的生長情況。

1.2.4 同工酶測定

按張丕奇等2008方法進行［6］。

1.3 數據處理與分析

1.3.1 相對遷移率（R f）

電泳結束后先在指示劑移動的位置（前沿）作標記，染色后，量出指示劑移動的距離和酶帶移動的距離。Rf=X2/X1。X1：固定染色前凝膠中指示劑的遷移距離；X2：固定染色后凝膠中酶蛋白區帶的遷移距，測量Rf時，以酶帶的中部位置為準。

1.3.2 相似系數

將凝膠上出現的條帶分類。按照條帶有無分別賦值，有帶記為1，無帶記為0。按Nei或Li（1997）公式計算菌株間的相似系數Se，其公式為：Se=2Mxy/(Mx+My+2Mxy)，式中,Mx為x菌株所獨有的譜帶數，My為y菌株所獨有的譜帶數，Mxy為x和y菌株所共有的譜帶數。

1.3.3 聚類分析

NTSYS－PC軟件進行聚類分析，構建黑木耳菌株相似系數樹狀圖譜。

2 結果與分析

2.1 黑木耳不同菌株菌絲形態

25個被試菌株按菌落形態分成6類，菌絲生長濃密、粗壯，絨毛氈狀，氣生菌絲旺，菌絲在平皿中生長分布均勻的為黑29、東A1、東A3、H W 9號菌株；菌絲生長稀疏、細弱，絨毛氈狀，氣生菌絲較弱，菌絲在平皿中生長分布不均勻，接種點周圍菌絲加密為 9808、東 A2、9809A、東 A4、東 A5、916、988、H W 5、958 號菌株；菌絲生長稀疏、細弱，絨毛氈狀，氣生菌絲弱，菌絲在平皿中生長分布均勻為8808、東A7、豐收2號菌株；菌絲生長較密、粗壯，成束，氣生菌絲旺，菌絲在平皿中生長分布均勻為981、伊耳1號菌株；菌絲生長濃密、粗壯，成束，氣生菌絲旺，菌絲在平皿中生長分布不均勻為長白7號、延明 1 號、931、888、898 號菌株；菌絲較密、較弱，成束，氣生菌絲較弱，菌絲在平皿中生長分布均勻為東A6號、長城1號菌株。其中菌絲呈絨毛氈狀的菌株占實驗菌株的64%，絨毛氈狀菌株氣生菌絲一般較弱，顏色灰白，有色素產生。菌絲成束的菌株氣生菌絲一般都較旺，菌絲潔白，產色素較絨毛氈狀弱。

2.2 黑木耳不同菌株親和性試驗

親和試驗可觀察出菌株間種、群親緣關系。對于親緣關系遠、完全獨立的異緣或基因型不同的菌株來說，它們間存在著不親和性反應。而對親緣關系近或基因型相同的菌株來說，它們之間表現為一定的親和性。實驗的9809、東A3號、9809A、長城1號、931和H W 5號菌株與其他被試菌株間不親和現象顯著，說明它們親緣關系遠，為各自獨立的菌株。888、898、958號間親和，東 A4、東 A5、東A6、東A7、916號間親和，981和H W 9號間親和，說明每兩個菌株之間親緣關系近。其它各菌株間均存在不同程度的不親和性，被認為是各自獨立的菌株，同時有些菌株間親和性較高，說明其同源性很高。

2.3 黑木耳不同菌株的酯酶同工酶酶譜

25個菌株酯酶同工酶酶譜見圖1，25個菌株共檢測257條酯酶同工酶譜帶，各菌株之間的遷移率分析可知，遷移率不同的譜帶有 17條，所有的譜帶均在 Rf 0.163～0.686之間，其中在Rf為0.163、0.539、0.637三處，25個菌株都有譜帶出現。供試的25個菌株得到了8個酶譜類型，其中黑木耳9809和東A3各為一個帶型；931為一個帶型；H W 5號為一個帶型；東 A4、東 A5、東 A6、東 A7、916、延明 1號、988、豐收2號、981、H W 9號菌株的帶型基本相同；8808、伊耳 1 號、888、898、958 號菌株帶型基本相同；黑 29、長白 7號、東 A1、東 A2號菌株的帶型基本相同；9809A、長城1號菌株的帶型基本相似。

圖1 供試25個菌株的酯酶同工酶酶譜Fig.1 Esterase isozyme zymogram of the 25 strains tested

2.4 酯酶同工酶的相似系數

25個菌株兩兩間遺傳相似系數（Se）的分布范圍在0.400～1.000之間，其中 9809、東 A3號、931、H W 5號各菌株與其它被試菌株的相似系數較小，說明它們在被試菌株中親緣關系較遠為各自獨立的菌株。東 A4、東 A5、東 A6、東 A7、916、延明 1 號、988、豐收2號、981、H W 9號等菌株間相似系數大，為 0.960 或 1.000；8808、伊耳 1 號、888、898、958 號菌株間相似系數為1.000，說明菌株遺傳背景相似或為同一菌株。

2.5 聚類分析

圖2 25個菌株的酯酶同工酶聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram based on esterase isozyme cluster analysis of the 25 strains tested

根據同工酶電泳結果，在凝膠的某個相同的遷移率位置上有條帶的記為1，無條帶的記為0。用NTSYS軟件進行聚類分析，得到了黑木耳菌株酯酶同工酶聚類分析圖（圖2），供試黑木耳菌株的酯酶同工酶遺傳相似性在0.53～1.00之間。從聚類分析樹狀圖可以直觀看出，當遺傳相似水平為70%時，測試的25個東北地區黑木耳菌株被聚類成三大類群。當遺傳相似水平為80%時，測試的25個黑木耳菌株可分為六大類群。第一類群：黑29、東A1、東A2、東 A3、東 A4、東 A5、東 A6、東 A7、916、延明 1號、988、豐收2號、981、H W 9號菌株；第二類群：8808、伊耳 1 號、888、898、958 號；第三類群包括931、H W 5號；第四類群有：9809A、長城 1 號；第五類群有長白7號；第六類群有9809號。

3 討 論

同工酶作為基因編碼的產物，表達的信息是DNA分子水平上的信息，作為分子遺傳標記技術之一，它彌補了以菌落形態、顏色、孢子形態和子實體形態等特征傳統真菌分類的不足，已成為屬內種間以及品種之間的分類鑒定的有效手段。同工酶分析已被廣泛應用于各種食用菌的鑒別和遺傳多樣性研究［7-9］。

從供試菌株的酶譜帶型和聚類分析可以看出，部分菌株之間的帶型相似或者相同，相似系數也很高，甚至達到1.0，初步可以確認這些菌株之間親緣關系很近，特別都是來自同一地區的菌株，如東A5、東 A6、東 A7、916、延明 1 號、988 相似系數達1.000；東 A4、豐收 2 號、981、H W 9 號菌株間相似系數為 1.000；8808、伊耳 1 號、888、898、958 號菌株間相似系數為1.000。這可能與各地互相穿插引種、菌種管理混亂等有關。近年來，隨著黑木耳栽培產業不斷擴大和研究工作的深入加強，越來越多的新菌株、新品種通過不同選育手段獲得，積累了越來越多的在遺傳學上的新品種。但是這些新菌株也完全有可能與過去用的菌株是同一個品種，也就是同種異名，有些菌株在多年的栽培選育過程中雖有所變化，但變化不大，菌株間的相似系數就較大。這其實可能也是本試驗中聚類結果相似度高的主要原因之一。

菌絲形態、親和性分析及酯酶同工酶技術用于菌種鑒定研究表明，菌絲形態與同工酶譜間相關性不大，形態相同的菌株在酶帶表現上可能相差很遠。親和性的結果與同工酶間表現出一定相關性，不親和菌株同工酶譜帶差異較明顯。酯酶同工酶分析技術作為鑒別種和品種以下菌株的有效分析手段在混淆菌株的區分方面顯示了它的實用性和有效性。本試驗分析的25個菌株在Rf為0.163、0.539、0.637三處都有譜帶出現，這可能是黑木耳的共有酯酶酶帶。25個黑木耳菌株酯酶多態性比較高，帶型類型比較豐富，菌株之間也普遍存在差異，在嚴格統一的條件下，其穩定性和重復性也比較好，并且在一定程度上也可以反應出某些菌株之間可能存在同物異名等現象。同時由于其操作簡單、經濟，且不需要復雜的設備，所以在黑木耳品種鑒定、種質資源評價等方面有比較高的應用價值。

本實驗采用洋蔥汁為同工酶誘導培養基，該培養基未人為添加其他蛋白，這為保證酶樣的純度提供優良的誘導體系，可使菌株被誘導產生豐富的多態性條帶，利于菌株的準確區分鑒定。

［1］杜萍，陳艷秋.7個桑黃菌株酯酶同工酶的研究［J］.中國食用菌，2006，25(2):40～42.

［2］秦俊哲，姚艷芳，孫偉.18個靈芝菌種的酯酶同工酶分析［J］.陜西科技大學學報，2006，24（6）：65～69.

［3］傅安濤,宋愛榮,丁偉,等.15個灰樹花菌株的酯酶同功酶分析［J］.中國食用菌，2007，26(1):40～42.

［4］韓增華，張介弛，戴肖東，等.六株黑木耳兩種同工酶的研究［J］.中國食用菌，2002，21(6):42～45.

［5］唐利華,郭倩,王瑞娟，等.中國黑木耳主栽菌株酯酶同工酶的研究［J］.食用菌學報，2007，14（4）：37～40.

［6］張丕奇，韓增華，戴肖東，等.培養時間對黑木耳酯酶同工酶的影響［J］.菌物研究，2008，6(2):106～109.

［7］邊銀丙，吳康云，伍昌勝.黑木耳種內雜交子同工酶基因座的遺傳分析［J］.遺傳學報，2003，30（1）：76～80.

［8］王波，彭衛紅，甘炳成.金針菇33個菌株遺傳多樣性與組織分離菌株鑒定的酯酶同工酶分析［J］.西南農業學報，2008，21（2）：448～450.

［9］賈建航，劉國振，李莉云.酯酶同工酶IEF電泳及香菇品種鑒別［J］.河北農業大學學報，1997，20（1）：1-5.