耐高溫產乙醇釀酒酵母菌S-13的特性研究

宋 丹，喻子牛，蔡 皓

(農業微生物學國家重點實驗室，微生物農藥國家工程研究中心，華中農業大學生命科學技術學院，湖北 武漢 430070)

乙醇是一種飲料，也是一種綠色燃料，更是一種戰略物資，世界上2/3的乙醇被用作燃料[1]。20世紀90年代，乙醇成為最具發展潛力的石油替代品，將其脫水并添加適量汽油后可以制成變性燃料乙醇，為液態燃料和化工原料提供了一種有充足選擇余地的新能源[2]。

工業上常用的乙醇發酵菌株有K字酵母、南陽1300酵母、南陽1308酵母、拉斯2號、拉斯12號、古巴I和古巴Ⅱ等等，均屬于釀酒酵母[3]。乙醇生產對酵母菌株的生理特性有一定的要求：(1)發酵力強且迅速；(2)繁殖速度快，有較強的增殖能力；(3)耐乙醇能力強，能在較高濃度的乙醇發酵醪中發酵；(4)耐溫性能好，能在較高溫度下發酵；(5)抵抗雜菌能力強；(6)耐酸能力強；(7)生產性能穩定，變異性小，發酵時產生的泡沫少[4]。要維持穩定高效的發酵生產，溫度、pH值及外部環境的滲透壓是重要的影響因素。因此，工業發酵生產還要求發酵菌株不僅要具有良好發酵性能，同時要能耐受高溫、高糖、高滲透壓[5]，才能夠節約冷卻用水、降低能耗、縮短發酵時間[6]，提高乙醇的生產效率和設備的利用率[7]。

作者以自行分離保藏的耐高溫產乙醇釀酒酵母S-13為出發菌株，通過連續傳代轉接實驗對其性能進行研究，以期為S-13利用甜高粱秸稈汁連續發酵生產乙醇提供依據。

1 實驗

1.1 菌種

耐高溫產乙醇釀酒酵母菌S-13(最適生長溫度和產乙醇最適溫度均為37 ℃)，自行保藏。

1.2 培養基

菌種保藏培養基(g·L-1)：葡萄糖20，酵母抽提物3.5，蛋白胨3.5，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 1.0，(NH4)2SO41.0，瓊脂20，pH值5.0。

斜面培養基(g·L-1)：葡萄糖30，酵母抽提物5.0，蛋白胨5.0，KH2PO43.0，瓊脂20，pH 值5.0。

種子液培養基(g·L-1)：葡萄糖50，酵母抽提物10，蛋白胨15，KH2PO49.0，MgSO4·7H2O 2.0，pH值5.0。

發酵培養基(g·L-1)：葡萄糖180，酵母抽提物4.0，蛋白胨5.0，KH2PO40.4，(NH4)2SO41.0，MgSO4·7H2O 0.2，pH值自然。

上述培養基均采用濕熱滅菌法處理，即115 ℃滅菌 25 min。

1.3 性能研究

1.3.1 生長曲線的繪制

將活化后的斜面菌株轉接到30 mL種子液培養基中，于37 ℃、180 r·min-1振蕩培養，每隔2 h取樣，以培養時間為橫坐標、種子液OD600值(稀釋10倍)為縱坐標，繪制菌株S-13的生長曲線。

1.3.2 遺傳穩定性測定

將活化后的種子液以4%的接種量轉接到發酵培養基中，每轉接培養1次即為1代。以發酵液中乙醇濃度為指標，根據乙醇濃度變化范圍確定其穩定性。

1.3.3 耐乙醇性測定

配制乙醇體積分數分別為6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%的發酵培養基各100 mL，接入已活化好的菌株，以不加乙醇的發酵培養基作對照，于37 ℃恒溫培養。觀察生長量和產氣情況，測定發酵液的CO2失重量。

1.3.4 熱致死溫度測定

將接種后的發酵液試管浸入水浴鍋中，以不接種的發酵液試管作為空白管，其中插入溫度計，當空白管的溫度達到40 ℃時，開始記錄時間，并保持10 min，然后立即拿出，在冷水中冷卻至室溫，最后將試管置于37 ℃恒溫培養箱中培養。同法測定其它溫度下，杜氏小管中的產氣情況。

1.3.5 發酵力測定

將活化后的種子液以4%的接種量轉接到發酵培養基中，于37 ℃、180 r·min-1振蕩培養。每隔12 h稱重一次，繪制CO2失重量與時間的關系曲線。

1.3.6 耐糖性測定

配制葡萄糖質量分數分別為18%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%的發酵培養基各100 mL，接種后于37 ℃恒溫培養48 h。繪制乙醇濃度、OD600值與葡萄糖質量分數的關系曲線。

1.3.7 耐酸堿性測定

配制不同pH值(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的發酵培養基，接種后于37 ℃培養48 h，測定不同pH值條件下酵母菌的OD600值及發酵力。

1.3.8 耐滲能力測定

配制不同質量分數的NaCl (1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%)發酵培養基，分裝于發酵液試管中，接種后于37 ℃培養48 h，觀察杜氏小管中的產氣情況。

1.4 分析檢測

1.4.1 乙醇濃度的測定

采用蒸餾法。取成熟發酵液100 mL加入100 mL蒸餾水，混勻后蒸餾，收集100 mL餾出液，用乙醇計測定乙醇濃度，同時測量餾出液的溫度，換算出20 ℃時的乙醇濃度。

1.4.2 生物量的測定

取培養好的種子液，離心收集菌體，用蒸餾水稀釋適當倍數，以蒸餾水作對照，用722型分光光度計在600 nm下測定OD600值。

1.4.3 CO2失重量的測定

將活化后的種子液轉接到100 mL發酵培養基中，37 ℃培養，以不接種子液的發酵液作對照。每隔12 h稱重一次，以相鄰2次的質量差值作為CO2失重量。當CO2失重量小于0.1 g時發酵結束。

1.4.4 發酵產氣的測定

將盛有10 mL發酵液的試管(內含杜氏小管)滅菌后，接入活化的種子液0.5 mL，以不加種子液的試管作對照。接種后于37 ℃培養48 h，觀察杜氏小管中的產氣情況。

2 結果與討論

2.1 菌株S-13的生長曲線

在乙醇發酵生產過程中選擇處于對數生長期、生理狀態一致的酵母菌進行接種是十分必要的，因為該時期酵母菌的個體形態、化學組成、生理特性等均較一致，接種后遲滯期短，起酵快[8]。以培養時間(h)為橫坐標、種子液的OD600值為縱坐標，繪制菌株S-13的生長曲線，結果如圖1所示。

圖1 菌株S-13的生長曲線

由圖1可以看出，隨著培養時間的延長，OD600值不斷增大，即菌體數增加；在培養12～14 h時，酵母菌處于對數生長期末期，OD600值達到較大值。因此，確定種子液的最佳培養時間為12～14 h，此時酵母菌的生長量大，活力較強，適合作為種子進行接種。

2.2 菌株S-13的遺傳穩定性

根據經典微生物學方法，判斷一個菌種是否具有遺傳穩定性，至少需要轉接20代來驗證。為了驗證菌株S-13是否具有很好的遺傳穩定性，對其進行了20代傳代實驗，測定每代發酵液中乙醇濃度，結果見表1。

表1 菌株S-13各代發酵液中乙醇濃度

由表1可以看出，菌株S-13的遺傳穩定性在20代之內相對較好，產乙醇能力基本保持不變，每相鄰2代的乙醇濃度相對誤差小于5%。

2.3 菌株S-13的耐乙醇性

酵母菌在發酵液中發酵，到某一時刻即停止，其最大原因是由于乙醇濃度增大所致，高乙醇濃度對酵母的生長繁殖有延滯作用，會抑制其發酵活性。因此，酵母的發酵能力在很大程度上取決于它們自身對乙醇耐受力的大小[9]。通過比較酵母菌在不同乙醇體積分數培養基中的CO2失重量及產氣情況，對其耐乙醇性進行分析，結果見圖2、表2。

圖2 菌株S-13在不同乙醇體積分數下的CO2失重量

表2 菌株S-13在不同乙醇體積分數下的產氣情況

由圖2、表2可知，菌株S-13在乙醇體積分數≤12%時產氣速度快，產氣量大；在乙醇體積分數為14%時能夠進行發酵但是發酵力較小；當乙醇體積分數高于16%時酵母菌生長受到限制，CO2失重量小于0.1 g·(100 mL)-1，沒有發酵力。因此，菌株S-13對乙醇的耐受能力為14%(體積分數)。

2.4 菌株S-13的熱致死溫度

液態培養的微生物，在某溫度下10 min即被殺死，此溫度稱為微生物的熱致死溫度[10]。通常情況下以測得的能發酵的最高溫度加1～2 ℃為該菌的熱致死溫度。以發酵產氣情況為依據，在菌株S-13最適生長溫度37 ℃的基礎上檢測其熱致死溫度，結果見表3。

表3 菌株S-13在不同溫度下的產氣情況

由表3可知，65 ℃下水浴10 min后，進行恒溫培養仍然可以發酵產氣，而70 ℃以后則不能產氣。因此，確定菌株S-13的熱致死溫度為66～67 ℃。

2.5 菌株S-13的發酵力

酵母菌的發酵力反映酵母菌的發酵狀況，一般包括CO2失重量、發酵度和乙醇濃度[11]。本實驗以CO2失重量確定菌株S-13的發酵力，菌株S-13的CO2失重量與發酵時間的關系曲線見圖3。

圖3 菌株S-13在不同時間內的CO2失重量

由圖3可知，發酵0～48 h菌株S-13的CO2失重量最大，這一階段的發酵速度最快，處于繁殖旺盛期；發酵60 h后菌株S-13的發酵速度明顯減慢，發酵力大幅下降；發酵120 h后，CO2的失重量幾乎不變，菌株S-13的發酵力最弱，發酵基本結束。因此，確定菌株S-13的適宜發酵時間為48 h。

2.6 菌株S-13的耐糖性

酵母菌的耐糖特性反映其對不同糖質量分數的適應情況。適合的葡萄糖質量分數會促進酵母菌的生長及乙醇的生產[12]。通過測定不同葡萄糖質量分數下發酵液的OD600值及產乙醇濃度，以確定菌株S-13對葡萄糖的耐受性，結果見圖4。

圖4 菌株S-13在不同葡萄糖質量分數下的生物量和乙醇濃度

由圖4可知，隨著葡萄糖質量分數的增大，酵母菌的生物量和乙醇濃度逐漸下降，說明高濃度的葡萄糖會對酵母菌的生長產生抑制作用，進而影響其產乙醇能力。菌株S-13在葡萄糖質量分數為60%的條件下仍能生長，表明其對葡萄糖的耐受能力為60%(質量分數)。

2.7 菌株S-13的耐酸堿性

酵母菌進行繁殖的適宜環境根據不同的菌株而有所區別[13]。通過測定不同pH值條件下菌株S-13的生物量及發酵力，以確定其耐酸堿性，結果見圖5。

圖5 菌株S-13在不同pH值下的生物量及CO2失重量

由圖5可知，菌株S-13在pH值5.0～6.0范圍內發酵力最強，CO2失重量達到3.4 g·(100 mL)-1；在pH值5.0～7.0范圍內生物量最大，OD600值達到7.5；在pH值2.0～9.0范圍內生物量與發酵力變化不明顯；而pH值大于9.0或者小于2.0時，酵母菌的發酵力及生物量顯著下降。表明菌株S-13在pH值2.0～9.0范圍內生長良好，具有廣泛的酸堿適應性。

2.8 菌株S-13的耐滲能力

當發酵醪液的滲透壓較高時，會引起酵母細胞內水分活度、細胞質組成發生顯著變化，細胞膜和菌體內的酶受到破壞，從而抑制酵母菌的生長和發酵。此外，培養基中無機鹽濃度的變化也會影響酵母菌的耗氧量、生長率和發酵率等生理功能[14]。以NaCl作為滲透壓調節劑，根據杜氏小管內氣體的產生快慢和產氣量的多少，確定菌株S-13耐滲能力，結果見表4。

由表4可知，較高的鹽濃度(即高滲透壓)對菌株S-13的產氣能力有明顯抑制作用。在NaCl質量分數為1%～5%范圍內菌株S-13的產氣能力變化不大，此后隨著NaCl質量分數的增大其產氣能力逐漸下降，耐滲能力逐漸降低，NaCl質量分數大于15%后不再產氣。說明菌株S-13的耐滲能力較好，對 NaCl的耐受能力為15%(質量分數)。

3 結論

以自行分離保藏的耐高溫產乙醇釀酒酵母S-13為出發菌株，對其性能進行了全面研究。結果表明，菌株S-13具有較好的遺傳穩定性、耐乙醇性、耐熱性、耐糖性、耐滲能力以及酸堿適應性。其種子液的最佳培養時間為12～14 h，最佳發酵時間為48 h；遺傳穩定性在20代之內相對較好，每相鄰2代的乙醇濃度的相對誤差小于5%，對乙醇的耐受能力為14%(體積分數)；熱致死溫度為66～67 ℃；對葡萄糖的耐受能力為60%(質量分數)；對NaCl的耐受能力為15%(質量分數)；在pH值2.0～9.0范圍內生長良好，為連續發酵生產乙醇提供了依據。

表4 菌株S-13在不同NaCl質量分數下的產氣情況

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