應用球面對稱設計優化兩相體系生物轉化合成5-氟尿苷

倪孟祥，趙 雨

(中國藥科大學微生物制藥教研室，江蘇 南京 210009)

5-氟尿苷(5-FUR) 是抗腫瘤核苷藥物脫氧氟尿苷(DFUR) 的合成中間體。脫氧氟尿苷是一種抗代謝類抗腫瘤藥，在體內可以部分轉化為氟尿嘧啶(FU)，二者具有相似的作用途徑和抗腫瘤譜[1]。脫氧氟尿苷的抗腫瘤活性高且毒副反應小，主要用于治療晚期結直腸癌和各種類型肝癌。目前，國內主要采用化學法合成脫氧氟尿苷，由于該法產物為多種核苷異構體和其它副產品的混合物，需要進一步分離，因此耗時費力、收率很低(約10%)。

1980 年，Utagawa 等首次報道了一種比化學法更為簡單、快速的酶合成法。這種方法主要是利用某些微生物中存在核苷磷酸化酶，它能催化一種核苷的堿基與另一種堿基互換，生成新的核苷[2]。酶法合成5-氟尿苷的反應過程如下：

5-氟尿嘧啶(5-FU)難溶于水，在轉化實驗中受溶解度限制雖轉化率較高但產量較低，本實驗室通過水/有機溶劑兩相體系[3]轉化解決這一問題。對于反應物為難溶物質的生物轉化反應，可用二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑、提高溶解度實現生物轉化[4]。

球面對稱設計是在球面設計的基礎上，實驗點分布在球面各卦限內中心點和球面與坐標軸的交點上，而以球心作為中心對照點的一種實驗設計[5]。球面對稱設計的優點是實驗次數與正交實驗相當，但實驗精度高，并且由此得到的關系式可以確定任何范圍內實驗點的預測值，對于需要控制指標和多指標的實驗，效果尤為顯著，因此已廣泛應用于藥物制劑配方優化、發酵條件優化、藥物提取工藝優化等[6]。

作者在此應用球面對稱設計研究了水/有機溶劑兩相體系對嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28+(PyNPase)生物轉化5-氟尿嘧啶為5-氟尿苷的影響。

1 實驗

1.1 菌種與培養基

菌種：嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28+(PyNPase)，自行構建并保存。

LB培養基：蛋白胨1 g，酵母浸出液0.5 g，NaCl 0.5 g，溶解于100 mL 2.5 mmol·L-1的PBS中，121 ℃滅菌20 min，置于烘箱中干燥，在超凈臺中控制好溫度加入40 μL 40 μg·mL-1卡那霉素。搖勻，倒入平板，冷卻后于37 ℃培養箱中保存。

20%玉米漿儲液的制備：取200 g干燥的玉米漿干粉，加1 L自來水加熱溶解，冷卻，用飽和NaOH溶液調pH值至7.0，過濾除沉淀，121 ℃滅菌20 min。重新調pH值至7.0，過濾，補水至1 L后再次滅菌，于4 ℃冰箱中保存。

玉米漿培養基：玉米漿儲液20 mL，牛肉膏1.5 g，KH2PO4·2H2O 0.019 g，Na2HPO4·12H2O 0.129 g，溶解于80 mL 2.5 mmol·L-1的PBS中調pH值至7.2，121 ℃滅菌20 min。接種前加40 μL 40 μg·mL-1卡那霉素。

發酵培養基：玉米漿儲液20 mL，牛肉膏1.5 g，KH2PO4·2H2O 0.019 g，Na2HPO4·12H2O 0.129 g，NaCl 0.1 g，MgSO40.02 g，CaCl20.04 g，ZnSO40.004 g，硼酸鈉0.004 g，溶解于80 mL 2.5 mmol·L-1的PBS中調pH值至7.2，121 ℃滅菌 20 min。接種前加40 μL 40 μg·mL-1卡那霉素。

1.2 試劑與儀器

尿苷，上海聚緣生物科技有限公司；5-氟尿嘧啶，上海瀚鴻生化有限公司；5-氟尿苷標準品，美國Sigma公司；其余試劑均為國產分析純。

Agilent 1100型高效液相色譜儀，美國；臺式水浴恒溫振蕩器，太倉市光明分析儀器廠；7522G型分光光度計，上海第三分析儀器廠；ISF-1-W型搖床，瑞士科耐。

1.3 方法

1.3.1 菌體培養

挑取平板上的E.coliBL21單菌落接種于裝有玉米漿培養基的搖瓶中進行種子液培養，于37 ℃、200 r·min-1培養16 h；再按1%的接種量接種于裝有發酵培養基的搖瓶中，于37 ℃、200 r·min-1培養8 h，加入50 μL 0.05 mmol·L-1IPTG，于31 ℃、200 r·min-1培養10 h。

1.3.2 濕菌體的制備

培養液在4 ℃、8000 r·min-1冷凍離心8 min，棄上清，沉淀加入10 mmol·L-1pH值為7.0的PBS重懸，EP管分裝，于12 000 r·min-1離心8 min，棄上清及上層黑色物質。精確稱重，于4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.3 5-氟尿苷標準曲線的繪制

精密稱取一定量的5-氟尿苷標準品粉末，以純凈水溶解制成濃儲液，再以一定比例稀釋，HPLC檢測，繪制標準曲線。

1.3.4 單水相體系微生物轉化反應

取10 mmol·L-1尿苷、46 mmol·L-15-氟尿嘧啶、0.7 g·L-1濕菌體，以40 mmol·L-1PBS(pH值為7.4，下同)為溶劑，混勻，于50 ℃、150 r·min-1振蕩反應1 h后加入1/3體積的200 mmol·L-1鹽酸或者放置冰箱冷卻10 min，終止反應，用0.22 μm微孔濾膜過濾，HPLC分析產物。

1.3.5 兩相體系微生物轉化反應

取20 mmol·L-1尿苷、不同體積分數DMSO的飽和5-氟尿嘧啶溶液、1.4 g·L-1濕菌體，以DMSO和40 mmol·L-1PBS為溶劑，混勻，后續操作同1.3.4。

1.4 分析測試

菌體生長量的測定：以空白不接菌種的培養基為對照，測定OD600。

5-氟尿嘧啶溶解度的測定：以結晶析出法測定室溫時的溶解度。溶劑為DMSO、正己烷、叔丁醇、PBS、不同體積比的DMSO與PBS的混合溶液。

5-氟尿苷產量的測定：HPLC法。測定條件：采用漢邦C18柱，流動相為50 mmol·L-1磷酸二氫鈉-純甲醇(9∶1)，流速1 mL·min-1，進樣量10 μL，檢測波長260 nm，柱溫30 ℃。

2 結果與討論

2.1 有機溶劑的確定

室溫時，5-氟尿嘧啶在不同溶劑中的溶解度見表1。

表1 5-氟尿嘧啶在不同溶劑中的溶解度

由表1可知，DMSO為溶劑時，5-氟尿嘧啶的溶解度最高。

在不改變5-氟尿嘧啶濃度的前提下，考察DMSO體積分數對5-氟尿嘧啶轉化率的影響，結果見圖1。

圖1 DMSO體積分數對5-氟尿嘧啶轉化率的影響

由圖1可知，DMSO體積分數小于30%時對5-氟尿嘧啶轉化率的影響很小；之后隨著DMSO體積分數的增大，轉化率明顯下降。這是由于，低劑量DMSO對細胞或微生物的生長無明顯影響[7]。因此，選擇體積分數為30%的DMSO作為有機相進行后續實驗。

2.2 DMSO體積比(以反應物總體積計，下同)對5-氟尿嘧啶轉化率的影響

DMSO體積比對5-氟尿嘧啶溶解度提高倍數(與pH值為7.4的PBS相比)的影響見表2。DMSO體積比對5-氟尿苷產量的影響見圖2。

表2 DMSO體積比對5-氟尿嘧啶溶解度提高倍數的影響

圖2 DMSO體積比對5-氟尿苷產量的影響

由圖2可知，隨DMSO體積比的增大，5-氟尿苷產量逐漸提高；DMSO體積比為30%時，5-氟尿苷產量達到最大；隨后由于高劑量的DMSO對酶活力影響較大，5-氟尿苷產量有所下降。雖然有機溶劑對轉化率有一定負面影響，但在增加5-氟尿嘧啶溶解度的前提下，5-氟尿苷產量依然較高，約為單水相時的5倍。

2.3 反應溫度、反應時間、裝液量對5-氟尿嘧啶轉化率的影響

DMSO體積比為30%，考察反應溫度對5-氟尿嘧啶轉化率的影響，結果見圖3。

圖3 反應溫度對5-氟尿嘧啶轉化率的影響

由圖3可知，反應溫度為55 ℃時，5-氟尿嘧啶的轉化率達到最大。

調節兩相體系pH值為7.4、反應溫度為55 ℃，考察反應時間對5-氟尿嘧啶轉化率的影響，結果見圖4。

圖4 反應時間對5-氟尿嘧啶轉化率的影響

由圖4可知，反應時間為1.5 h時，兩相體系中5-氟尿嘧啶的轉化率最高。

裝液量對5-氟尿嘧啶轉化率的影響見圖5。

圖5 裝液量對5-氟尿嘧啶轉化率的影響

由圖5可知，裝液量為3 mL/50 mL時，5-氟尿嘧啶的轉化率最高。

2.4 球面對稱設計優化

以反應時間、反應溫度、裝液量為考察因素，每個因素選取5個水平，采用球面對稱設計，對5-氟尿嘧啶生物轉化合成5-氟尿苷的條件進行優化，其因素與水平見表3，結果見表4。每個水平重復3次，取平均值。

表3 球面對稱設計優化實驗因素與水平

將實驗數值進行計算機多元處理，得回歸方程為：

表4 球面對稱設計優化實驗結果

可以看出反應時間、反應溫度、裝液量對5-氟尿嘧啶的轉化率影響顯著。以轉化率(Y)為首要衡量指標，對回歸方程在最大值與最小值的范圍內進行偏回歸求解最大值，得到最優點：X1=1 h、X2=55 ℃、X3=4 mL·(50 mL)-1，理論轉化率為74.11%。

以上述選出的最優條件進行驗證實驗，5-氟尿嘧啶的轉化率達到 75.7%，高于單因素轉化實驗，說明該模型較好地預測了實際的結果。

2.5 討論

DMSO被稱為萬能溶劑，能溶解很多藥物，具有雙極性，細胞毒性低[7]，在微生物轉化反應中應用較廣。本實驗以水/DMSO為溶劑進行轉化反應，通過超聲等物理方式，在增加底物溶解度的前提下，確定DMSO對酶活影響很小，并且低劑量DMSO對5-氟尿嘧啶轉化率有一定的促進作用，與國外報道[3]相一致。但繼續增加DMSO體積分數，由于轉化率的急劇下降，5-氟尿苷的產量隨之降低。這可能是由于，核苷磷酸化酶具有磷酸依賴性，當DMSO體積分數過高時，會因為磷酸鹽比例的降低，不能滿足核苷磷酸化酶的轉化要求，因此高劑量DMSO對轉化率有較大的負面影響，如能解決這個問題，5-氟尿苷的產量將進一步提高。

3 結論

通過球面對稱設計優化，確定5-氟尿嘧啶生物轉化合成5-氟尿苷的最佳條件如下：DMSO體積分數30%、DMSO體積比(以反應物總體積計)30%、反應溫度55 ℃、pH值7.4、裝液量4 mL/50 mL、反應時間1 h，此時，5-氟尿嘧啶的轉化率達75.7%，5-氟尿苷的產量較單水相時提高近5倍。為5-氟尿苷的兩相體系生物轉化的工業化生產奠定了理論基礎。

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