深海微生物絮凝劑HBF-3的劑型研究

趙 妮，印 文，王階平，邵宗澤，喻子牛，何 進

(1.華中農業大學生命科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361000)

傳統絮凝劑包括無機絮凝劑和有機高分子絮凝劑兩類[1，2]，雖然絮凝性能優良，但用量大、費用高、會產生二次污染[3]。微生物絮凝劑(Microbial flocculant，MBF)與傳統絮凝劑相比，具有無毒無害、安全性高；可利用生物技術，通過微生物發酵、分離提取而大規模生產，因而成本低；產生菌易得，來源豐富，生產周期短且效率高；易被微生物降解，無二次污染；很強的除濁和脫色性能；pH值和熱穩定性強、用量小等特點[4，5]。已成為凈水領域的研究熱點。

微生物絮凝劑HBF-3是深海鹽單胞菌Halomonassp.V3a′ 分泌的相對分子質量約為2.3×105的胞外多糖，總糖含量為28.9%，其中，中性糖20.6%、糖醛酸7.2%、氨基糖1.1%[6]。在50 L發酵罐的中試生產中，HBF-3的產量可達5.4 g·L-1[7]。HBF-3具有絮凝活性高、作用譜廣和用量少等特點，因而具有很大的開發潛力和廣闊的應用前景[6，8]。作者在此采用冷凍干燥技術將發酵液制成固體劑型以及通過旋轉蒸發濃縮技術將發酵液制成液體劑型對微生物絮凝劑HBF-3的劑型進行研究，并添加合適的防腐劑，考察其絮凝活性，測試其保質期，擬為延長運輸及貨架保存期提供依據。

1 實驗

1.1 菌種與培養基

Halomonassp.V3a′是由國家海洋局第三海洋研究所從西太平洋深海沉積物中分離得到的鹽單胞菌Halomonassp.V3a經誘變獲得的高產絮凝劑菌株。

發酵培養基(g·L-1)：葡萄糖10.0，NH4Cl 1.0，KH2PO42.0，K2HPO45.0，酵母膏0.6，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 5.0，pH值7.5。

1.2 方法

1.2.1 絮凝劑HBF-3的發酵生產

種子培養：將活化后的菌種接種至培養基，于28 ℃、160 r·min-1培養至對數期。

搖瓶發酵：按3%的接種量將種子液接種至裝有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，28 ℃、160 r·min-1培養48 h，然后在常溫下靜置培養48 h。發酵液經10 000 r·min-1離心30 min，上清液即為絮凝劑HBF-3。

1.2.2 固體劑型的絮凝活性的測定

取發酵液上清，先在-40 ℃下預凍90 min，然后再于100 mt、-40 ℃冷凍干燥，即得到固體劑型的絮凝劑HBF-3。凍干的HBF-3復溶于水至凍干前的體積，參照文獻[7]測定其絮凝活性。

1.2.3 液體劑型的絮凝活性的測定

取發酵液上清，在壓力為-0.097 MPa、溫度為50 ℃條件下進行旋轉蒸發濃縮，直至體積為原發酵液的1/5，即得到液體劑型的絮凝劑HBF-3。HBF-3濃縮液經5倍稀釋后，參照文獻[7]測定其絮凝活性。

2 結果與討論

2.1 固體劑型HBF-3的絮凝活性

冷凍干燥能夠維持絮凝劑的原有形狀，使之不易干裂、收縮和硬化，最大限度地保持絮凝活性；同時，產品含水量低，易于運輸與貯藏，而且可延長保質期[9]。保護劑在冷凍干燥過程中能起到抗冷凍作用，使干燥過程較容易進行；同時也是一個很好的穩定基質，使再水化過程變得容易[10]。不同種類的保護劑對固體劑型HBF-3的絮凝活性的影響見表1。

表1 保護劑對固體劑型HBF-3絮凝活性的影響

由表1可知，添加5%蔗糖、5%蔗糖+5%甘露醇、10%脫脂奶粉+0.5%抗壞血酸+5%蔗糖保護劑，固體劑型HBF-3復溶后的絮凝活性均達到82%以上。這是因為，蔗糖具有很強的水化能力，能在絮凝劑表面形成穩定的水化保護層[11]。考慮到生產成本，以5%蔗糖為保護劑最為可行，而且凍干的HBF-3能夠迅速復溶于水，有利于后續的使用。

2.2 液體劑型HBF-3的絮凝活性

在一定壓強下，旋轉蒸發的速率與溫度和轉速相關。轉速大可使內部水分及時翻動到表面，增大了蒸發面積，從而加快蒸發速率[12]；但轉速越大，越容易起泡，不易控制。溫度過低，蒸發速率變慢；而溫度過高，對HBF-3絮凝活性會有影響。此外，隨著蒸發進行，濃度、粘度、水分遷移阻力相繼增大，蒸發速率逐漸趨緩。

經多次優化，確定液體劑型HBF-3的最優旋轉蒸發濃縮條件為：壓力-0.097 MPa，溫度50 ℃。將連續2次發酵得到的發酵液分別進行濃縮，濃縮前第一批上清活性為98.0%、第二批上清活性為97.4%，2批發酵液旋轉蒸發濃縮至1/5后，HBF-3濃縮液稀釋5倍后的絮凝活性分別為96.8%和94.3%。說明旋轉蒸發濃縮處理對HBF-3的絮凝活性影響不大。

2.3 防腐儲存

在液體劑型HBF-3中添加防腐劑于4 ℃儲存一個月后，稀釋至原始濃度后測得的絮凝活性見表2。

表2 液體劑型HBF-3添加防腐劑在4 ℃儲存一個月后的絮凝活性

由表2可知，儲存一個月后未添加防腐劑的HBF-3的絮凝活性有所下降，而添加防腐劑(無論是單一的還是組合的)，可以不同程度地保持HBF-3的絮凝活性。研究表明，HBF-3分子鏈中的活性基團和大分子的吸附架橋作用是促進膠體物質絮凝沉淀的最主要的作用力[13]，靜置后絮凝活性的提高可能是防腐劑本身的基團促進了吸附架橋作用。

表3為第一批HBF-3濃縮液添加防腐劑后于不同溫度儲存一個月后的絮凝活性。

表3 液體劑型HBF-3添加防腐劑后在不同溫度下儲存一個月后的絮凝活性

由表3可知，未添加防腐劑的HBF-3濃縮液于4 ℃儲存一個月后絮凝活性為92.1%，而在28 ℃、37 ℃、50 ℃儲存一個月后，基本無絮凝活性；添加1.0 g·L-1山梨酸鉀的HBF-3濃縮液在4 ℃、28 ℃、37 ℃、50 ℃儲存一個月后均能保持90%以上的絮凝活性；在37 ℃以下儲存一個月，只需要添加0.75 g·L-1山梨酸鉀就可以起到很好的防腐效果。這是因為，山梨酸鉀的抑菌效果隨pH值的降低而增強，pH值為3.0時抑菌效果達到最佳，而HBF-3濃縮液的pH值正好在3.0左右，因此山梨酸鉀是HBF-3絮凝劑的良好防腐劑。在28 ℃儲存時，復合防腐劑0.75 g·L-1山梨酸鉀+0.75 g·L-1雙乙酸鈉較單一防腐劑0.75 g·L-1山梨酸鉀的防腐效果要好。這是因為，雙乙酸鈉是霉菌和細菌的高效抑制劑，尤其是對黃曲霉毒素有較強的抑制作用[14]，在霉菌和細菌容易生長的溫度下添加適量的雙乙酸鈉可以達到比較好的防腐效果。

本實驗中防腐劑用量均未超出它們在食品中的限量，因此進行水處理時，HBF-3與懸浮物一起沉入水底，不會影響水質。

3 結論

對微生物絮凝劑HBF-3的劑型進行了研究。結果表明，以5%蔗糖為保護劑，經冷凍干燥制成固體劑型，凍干的HBF-3復溶后的絮凝活性為82.4%；旋轉蒸發濃縮至1/5制成液體劑型，濃縮液稀釋5倍后的絮凝活性與初始發酵液相比，變化不大；濃縮液添加1.0 g·L-1山梨酸鉀，在4 ℃、28 ℃、37 ℃、50 ℃儲存一個月后能夠保持較高的絮凝活性。為HBF-3絮凝劑的大規模發酵生產提供了重要的理論依據，也為HBF-3的推廣應用奠定了基礎。

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