種子擴大培養(yǎng)過程對類人膠原蛋白規(guī)模化生產(chǎn)的影響

薛文嬌，范代娣

(1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.西北大學化工學院 陜西省可降解生物醫(yī)藥材料重點實驗室，陜西 西安 710069)

種子擴大培養(yǎng)過程對于發(fā)酵過程雖是一個獨立的變量，卻是影響發(fā)酵過程效率和經(jīng)濟性的關(guān)鍵因素之一[1]。在小規(guī)模實驗室發(fā)酵過程中觀測到的過程變化很多都是由于接入的種子條件有所變化造成的；在發(fā)酵放大過程中，合適的種子擴大培養(yǎng)過程的建立對于放大培養(yǎng)也至關(guān)重要[2]。據(jù)報道，接入的種子年齡及種子密度都直接影響著滯后期的長短、比生長速率、細胞得率、成孢子性及最終產(chǎn)品的質(zhì)量，從而影響生產(chǎn)成本[1]。

類人膠原蛋白(Human-like collagen，HLC)是利用基因工程技術(shù)將人體膠原蛋白的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)酶切修飾并進行特定的序列重復后重組于E.coli內(nèi)，經(jīng)過高密度發(fā)酵生產(chǎn)出來的一種高分子生物蛋白，該蛋白不但維持了膠原蛋白的特性，并由于其獨特的重復結(jié)構(gòu)，賦予其新的特性，因此應(yīng)用領(lǐng)域更加廣闊[3]。在HLC的生產(chǎn)放大過程中，為了獲得足夠多的接種量，需要增加種子的培養(yǎng)階段。鑒于中試生產(chǎn)罐為500 L規(guī)模，作者在此采用50 L的種子罐進行第三級種子培養(yǎng)，以中試規(guī)模的最終菌體濃度、目標蛋白濃度及目標蛋白產(chǎn)率為考核指標，考察三級種子培養(yǎng)過程中不同移種階段和不同種子培養(yǎng)基對發(fā)酵過程的影響，以確定最優(yōu)條件。

1 實驗

1.1 菌種與培養(yǎng)基

基因工程菌E.coliBL21，卡那抗性，溫度誘導；質(zhì)粒pNWCP31，自行構(gòu)建并保存[4]。

種子培養(yǎng)基采用固體LB培養(yǎng)基和液體LB培養(yǎng)基，三級種子培養(yǎng)基由實驗確定，發(fā)酵培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基成分同文獻[4]。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)

從LB平板上刮取單菌落，置于盛有50 mL種子培養(yǎng)基的300 mL搖瓶中，于32 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)10 h；然后將一級種子轉(zhuǎn)接入盛有50 mL種子培養(yǎng)基的300 mL搖瓶中，在相同的條件下培養(yǎng)10 h。

1.2.2 三級種子培養(yǎng)

將已培養(yǎng)好的二級種子培養(yǎng)液接種到裝有24 L三級種子培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中，控制溫度在32 ℃。在三級種子培養(yǎng)過程中，通過調(diào)節(jié)空氣流量、提高攪拌轉(zhuǎn)速和罐壓以控制DO在20%空氣飽和度，用25%(質(zhì)量分數(shù)，下同)氨水自動調(diào)節(jié)pH值為6.8。

1.2.3 分批-補料培養(yǎng)

將已培養(yǎng)好的三級種子培養(yǎng)液接種到裝有240 L發(fā)酵培養(yǎng)基的500 L發(fā)酵罐中，控制溫度為32 ℃、空氣進氣流量為600 L·min-1。在分批-補料培養(yǎng)階段，通過提高攪拌轉(zhuǎn)速控制DO在20%空氣飽和度，用25%氨水自動調(diào)節(jié)pH值為6.8。當發(fā)酵罐中的葡萄糖耗盡時，采用近指數(shù)的補料方法控制比生長速率[5]。當OD600達到95(約45 g·L-1細胞干重)時，升溫至42 ℃開始誘導，3 h后降溫至39 ℃，繼續(xù)誘導4～6 h。

1.2.4 移種階段的確定

分別在細胞生長的對數(shù)期前期、中期、后期及穩(wěn)定期移種，考察中試規(guī)模菌體濃度、目標蛋白濃度及目標蛋白產(chǎn)率，以確定最佳移種階段。

1.2.5 三級種子培養(yǎng)基的確定

種子培養(yǎng)基的選擇是獲得合適的種子培養(yǎng)物的關(guān)鍵因素之一。Lincoln[6]認為，選擇生產(chǎn)階段的發(fā)酵培養(yǎng)基作種子培養(yǎng)基可以縮短滯后期。而使用和發(fā)酵培養(yǎng)基完全不同的培養(yǎng)基作種子培養(yǎng)基是非常危險的，因為兩種培養(yǎng)基的pH值、滲透壓以及陰離子差距過大可能會引起細胞吸收速率的突然改變，從而影響細胞的存活性[7]。因此，本實驗除葡萄糖和酵母粉外，三級種子培養(yǎng)基中其它成分的濃度與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。保持葡萄糖和酵母粉濃度比值不變，調(diào)節(jié)葡萄糖濃度分別為10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1、25 g·L-1、30 g·L-1、40 g·L-1，均在對數(shù)期后期移種，考察中試規(guī)模菌體濃度、目標蛋白濃度及目標蛋白產(chǎn)率，以確定最佳種子培養(yǎng)基。

1.2.6 分析方法

葡萄糖濃度：斐林試劑法[8]。

細胞密度：取10 mL發(fā)酵液，離心，棄上清液，將沉淀用重蒸水洗滌3遍后，60 ℃烘干至恒重。計算單位體積發(fā)酵液中細胞干重，即為細胞密度。

乙酸濃度：RP-HPLC法[9]。

類人膠原蛋白表達量：取10 mL發(fā)酵液，離心，棄上清液，將沉淀用重蒸水洗滌3遍后，重懸浮，超聲波破碎，用羥脯氨酸測定法[10]測量破碎上清液中類人膠原蛋白含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 三級種子培養(yǎng)過程特點

將搖瓶培養(yǎng)的二級種子(OD600達到2.4)接種到50 L種子罐進行三級種子培養(yǎng)(培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為20 g·L-1，其它成分同發(fā)酵培養(yǎng)基)，考察其培養(yǎng)過程特點，結(jié)果如圖1所示。

圖1 三級種子培養(yǎng)過程的特征曲線

由圖1可以看出，該細胞生長過程符合一般分批培養(yǎng)的細胞生長動力學，即該過程基本由4個階段組成：滯后期、對數(shù)期、穩(wěn)定期與衰亡期(由于培養(yǎng)時間較短，衰亡期在圖中表現(xiàn)不明顯)。在對數(shù)期，細胞生長最快，比生長速率(μ)達到最大，約為0.7 h-1。在對數(shù)期與穩(wěn)定期之間還存在一個減速期。乙酸濃度在減速期就開始下降，達到穩(wěn)定期時其濃度已接近于0。由于減速期持續(xù)時間較短，同時其生理特征介于對數(shù)期和穩(wěn)定期之間，故在后續(xù)移種階段的考察中未考慮該階段。

2.2 移種階段的確定

根據(jù)三級種子培養(yǎng)過程的特征曲線，分別在細胞生長的對數(shù)期前期(培養(yǎng)時間3 h)、中期(培養(yǎng)時間5 h)、后期(培養(yǎng)時間7 h)及穩(wěn)定期(培養(yǎng)時間10 h)移種，移種體積為發(fā)酵培養(yǎng)基初始體積的10%，考察移種階段對發(fā)酵過程的影響，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，在對數(shù)期各階段移種，對最終的DCW及HLC濃度幾乎沒有影響，HLC表達量也相差不大，但是培養(yǎng)時間不等，并最終導致HLC平均產(chǎn)率不同。在對數(shù)期后期移種，HLC平均產(chǎn)率最高，達到0.518 g·L-1·h-1。這主要是因為在對數(shù)期后期移種，種子培養(yǎng)期達到的細胞密度最高，而種子活力及比生長速率與對數(shù)期前期及中期基本相同，因此接入到生產(chǎn)罐時，達到同樣細胞密度所需的時間最短。

表1 移種階段對發(fā)酵過程的影響

由表1還可知，在穩(wěn)定期移種，HLC表達量最高，而最終HLC濃度卻最低。這是因為，最終DCW(52.4 g·L-1)相比對數(shù)期移種有很大程度的降低(約降低17%)。盡管有研究表明，相比對數(shù)期接種，穩(wěn)定期接種可提高質(zhì)粒穩(wěn)定性[11]。但本研究所使用的表達體系和發(fā)酵體系的質(zhì)粒穩(wěn)定性較好，因此穩(wěn)定期接種與對數(shù)期接種相比，其質(zhì)粒穩(wěn)定性的提高并不明顯，反而導致細胞活性降低、滯后期延長，最終DCW降低，進而導致最終HLC濃度及平均產(chǎn)率降低。

2.3 種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的確定

培養(yǎng)基濃度高，得到的種子密度高，發(fā)酵過程所需的時間較短，目標蛋白產(chǎn)率就高；但培養(yǎng)基濃度過高，會導致乙酸等有害副產(chǎn)物濃度增加，影響移種細胞的生理狀態(tài)，從而影響發(fā)酵過程及目標蛋白產(chǎn)率。此外，對于重組菌培養(yǎng)過程，其質(zhì)粒穩(wěn)定性對于目標蛋白產(chǎn)率非常重要。培養(yǎng)基濃度過高，可能會延長對數(shù)生長期，而細胞在高速生長時，其質(zhì)粒的丟失率也較高，因而會降低目標蛋白表達量。在HLC生產(chǎn)過程中，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對發(fā)酵過程的影響見表2。

表2 種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對發(fā)酵過程的影響

由表2可知，當種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度低于20 g·L-1時，所需的培養(yǎng)時間較長，導致HLC平均產(chǎn)率較低；當種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度高于20 g·L-1時，由于質(zhì)粒丟失，最終HLC濃度降低，同時HLC表達量降低；特別是當種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為40 g·L-1時，不僅最終HLC表達量降低，最終DCW也急劇降低，其原因可能是在該批次種子培養(yǎng)過程中，鑒于設(shè)備供氧能力，無法保持DO在20%空氣飽和度，從而可能導致混合酸發(fā)酵副產(chǎn)物，影響種子存活力。因此，在三級種子培養(yǎng)過程中，其培養(yǎng)基中葡萄糖濃度宜選擇20 g·L-1，其后發(fā)酵過程所需的培養(yǎng)時間較短，HLC表達量較高，HLC平均產(chǎn)率最高達到0.518 g·L-1·h-1。

3 結(jié)論

研究了三級種子培養(yǎng)過程中不同移種階段及不同種子培養(yǎng)基對類人膠原蛋白發(fā)酵過程的影響。結(jié)果表明：在對數(shù)期后期移種，HLC平均產(chǎn)率最高；而穩(wěn)定期接種，卻導致細胞活性降低、滯后期延長，最終DCW、最終HLC濃度及HLC平均產(chǎn)率都較低。另外，當種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為20 g·L-1時，其后發(fā)酵過程所需的培養(yǎng)時間較短，HLC表達量較高，HLC平均產(chǎn)率最高，達到0.518 g·L-1·h-1。

[1] Sen R，Swaminathan T.Response surface modeling and optimization to elucidate and analyze the effects of inoculum age and size on surfactin production[J].Biochemical Engineering Journal，2004，21(2)：141-148.

[2] Stanbury P F，Whitaker A，Hall S J.Principles of Fermentation Technology (Second Edition)[M].Burlington：Butterworth-Heinemann，1995：147-166.

[3] 范代娣，段明瑞，米鈺，等.重組E.coli工程菌高密度培養(yǎng)生產(chǎn)人源型膠原蛋白[J].化工學報，2002，53(7)：752-754.

[4] Luo Y E，F(xiàn)an D D，Ma X X，et al.Process control for production of human-like collagen in fed-batch culture ofEscherichiacoliBL21[J].Chinese Journal of Chemical Engineering，2005，13(2)：276-279.

[5] 段明瑞，米鈺，范代娣.重組人源型膠原蛋白基因工程菌補料分批發(fā)酵過程動力學研究[J].化學反應(yīng)工程與工藝，2002，18(3)：238-243.

[6] Lincoln R E.Control of stock culture preservation and inoculum build-up in bacterial fermentation[J].Journal of Biochemical and Microbiological Technology and Engineering，1960，2(4)：481-500.

[7] Smith G M，Calam C T.Variations in inocula and their influence on the productivity of antibiotic fermentations[J].Biotechnology Letters，1980，2(6)：261-266.

[8] 張龍翔.生物化學實驗方法和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，1981：253-254.

[9] Suarez D C，Kilikian B V.Acetic acid accumulation in aerobic growth of recombinantEscherichiacoli[J].Process Biochemistry，2000，35(9)：1051-1055.

[10] 張玉娥.肺組織膠原蛋白測定方法的探討[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，1997，(4)：13-14.

[11] Sabatie J，Speck D，Reymund J，et al.Biotin formation by recombinant strains ofEscherichiacoli：Influence of the host physiology[J].Journal of Biotechnology，1991，20(1)：29-49.