微生物發酵法生產2，3-丁二醇的研究

蔣麗群，郭 峰，方 真，龍運多，張 帆

(1.中國科學院西雙版納熱帶植物園 熱帶植物資源開放實驗室生物能源組，云南 昆明 650223；2.中國科學院研究生院，北京 100049)

隨著化石燃料的短缺和石油價格的增長，應用生物方法生產化學產品的生物煉制技術倍受關注[1～3]。

2，3-丁二醇(2，3-BD)是一種極具價值的液體燃料，燃燒值為27 kJ·g-1，可以與甲醇(22 kJ·g-1)、乙醇(29 kJ·g-1)相媲美[4]，在能源、食品及化工等領域應用廣泛[5～7]，且在染料、增濕和柔順劑、炸藥、香水、藥物載體等領域顯示出潛在的應用價值[6，8，9]。因此，微生物發酵法生產2，3-BD已成為國內外研究的熱點[10～14]。

作者在此以相對廉價的尿素為唯一氮源、以葡萄糖為底物，采用Plackett-Burman實驗、最陡爬陂實驗以及中心復合實驗相結合的響應面法對產酸克雷伯氏菌發酵產2，3-BD的培養基進行了優化。

1 實驗

1.1 菌種與培養基

產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)CICC 22912，購自中國工業微生物菌種保藏中心。

固體培養基(g·L-1)：蛋白胨 5，牛肉膏 3，NaCl 5，瓊脂 20。

種子培養基(g·L-1)：蛋白胨 5，牛肉膏 3，NaCl 5，初始pH值6.8～7.0。

原始發酵培養基(g·L-1)：葡萄糖 100，K2HPO413.7，KH2PO43.9，(NH4)2SO46.6，(NH4)2HPO43.3，MgSO4·7H2O 0.25，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl20.01，EDTA 0.05。

上述培養基均在115 ℃下滅菌20 min(FeSO4·7H2O溶液配制完成后用孔徑0.22 μm的無菌雙層微孔濾膜過濾備用)。

1.2 培養方法

種子培養：將甘油管保藏的菌種轉接至固體培養基，37 ℃下活化12 h。將1環活化的菌種接種于裝有50 mL液體種子培養基的250 mL三角瓶中，在轉速為120 r·min-1的臺式恒溫搖床中，于37 ℃恒溫振蕩培養12 h，獲得種子液。

發酵培養：將上述種子液按體積分數為5%的接種量接種于裝有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，在轉速為150 r·min-1的臺式恒溫搖床中，于37 ℃恒溫振蕩培養80 h。

1.3 實驗設計

運用響應面法，采用 Design-Expert 8.0.2軟件進行實驗設計和數據分析，主要由以下3部分組成：

(1)Plackett-Burman實驗

根據微生物生長所需要的營養條件及微生物發酵的影響因子的一般規律，在單因素實驗的基礎上，進行Plackett-Burman實驗設計，其因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman實驗的因素與水平

(2)最陡爬坡實驗

爬坡實驗的起點為單因素實驗所確定的最優點，爬坡的方向由Plackett-Burman實驗的T值決定，T為正值時爬坡方向為遞增，T為負值時爬坡方向為遞減；爬坡的步長由T值和單因素實驗結果確定。

(3)中心復合實驗

根據響應面中心復合實驗的設計原理，以2，3-BD得率為響應值，設計2因素5水平共13個實驗點的實驗，其中包括4個析因設計實驗點、4個軸點設計實驗點以及5個中心點重復實驗實驗點。

1.4 分析方法

發酵液中的葡萄糖、2，3-BD以及3-羥基丁酮均采用高效液相色譜儀(島津CL-20A)測定。色譜柱為Aminex HPX-87H型離子色譜柱(300 mm×7.8 mm，Bio-Rad)，柱溫為60 ℃，流動相為0.005 mol·L-1H2SO4，流速為0.6 mL·min-1，檢測器為RID-10A。按下式計算2，3-BD得率(Y)：

式中：m1、m2、m3分別為2，3-BD、3-羥基丁酮、消耗的葡萄糖的質量，g。

2 結果與討論

2.1 Plackett-Burman實驗

以2，3-BD得率為響應值，每次實驗重復3次，取平均值。Plackett-Burman實驗結果見表2，顯著性分析見表3。

表2 Plackett-Burman實驗結果

表3 Plackett-Burman實驗的顯著性分析

由表3可知，X2和X7的P值小于0.05，這表明，尿素和乙酸對2，3-BD得率影響顯著，可通過最陡爬坡實驗和中心復合實驗進一步優化。而其它不顯著影響因素，根據系數或T值的正負確定該因素為表1中的高或低水平，不再進一步優化。如葡萄糖的T值為負，則選其低水平，即80 g·L-1。

2.2 最陡爬坡實驗

以單因素實驗確定的最佳水平(即尿素濃度為4.50 g·L-1、乙酸濃度為0.50 g·L-1)為起點，分別以0.30和0.10為步長，進行最陡爬坡實驗，結果見表4。

表4 最陡爬坡實驗結果

由表4可知，當尿素濃度為5.10 g·L-1、乙酸濃度為0.70 g·L-1時，2，3-BD得率最大。

2.3 中心復合實驗

中心復合實驗結果、回歸方程系數顯著性檢驗分析分別見表5和表6。

表5 中心復合實驗結果

表6 回歸方程系數顯著性檢驗

由表6得到擬合的多元二次方程為：

由Design-Expert 8.0.2繪制的響應面曲線圖及等高線圖見圖1。

由圖1a可知，響應值存在最大值。經軟件分析預測，當尿素=0.1(即5.13 g·L-1)、乙酸=0.03(即0.703 g·L-1)時，預測的2，3-BD最大得率為0.456 g·g-1。即最佳的發酵條件是：葡萄糖80 g·L-1，尿素5.13 g·L-1，CaCl20.01 g·L-1，EDTA 0.05 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，FeSO4·7H2O 0.05 g·L-1，乙酸 0.703 g·L-1，K2HPO412.55 g·L-1，KH2PO43.9 g·L-1。此時，2，3-BD的得率達到0.456 g·g-1，較初始條件提高了23.2%，達到了理論得率的91.2%。

圖1 響應面圖(a)及等高線圖(b)

為了檢驗模型預測的準確性，在最佳發酵培養條件下進行3組平行實驗，得到2，3-BD得率的平均值為0.454 g·g-1，與回歸方程的預測值基本一致。

由圖1b可知，等高線圖呈圓形，表明尿素和乙酸的交互作用不顯著。

3 結論

采用Plackett-Burman實驗、最陡爬坡實驗以及中心復合實驗相結合的響應面法對產酸克雷伯氏菌產2，3-丁二醇的培養基進行了優化。結果表明：

(1)相比于酵母粉、蛋白胨或銨鹽等氮源，本實驗采用較為廉價的尿素為唯一氮源，獲得了較高的2，3-丁二醇得率，具有經濟性和工業化發展潛力。(2)應用Plackett-Burman實驗對影響發酵的因子進行評價，結果發現尿素和乙酸的濃度對2，3-丁二醇得率具有顯著影響。(3)通過中心復合實驗，建立了發酵產2，3-丁二醇的數學模型，經分析得到尿素和乙酸的最佳組合為：尿素濃度5.13 g·L-1、乙酸濃度0.703 g·L-1。(4)在最佳發酵條件下，2，3-丁二醇得率達到0.456 g·g-1，相對于原始的發酵條件，得率提高了23.2%，達到了理論得率的91.2%。

該研究對進一步以富含葡萄糖的木質纖維素水解液為發酵底物產2，3-丁二醇的研究具有一定的指導意義，為木質纖維素資源的開發利用奠定了良好的基礎。

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