超聲水沖印壓系統(tǒng)：小型化及軟骨退化檢測

黃燕平，鄭永平

香港理工大學 醫(yī)療科技及資訊學系，香港

超聲水沖印壓系統(tǒng)：小型化及軟骨退化檢測

黃燕平，鄭永平

香港理工大學 醫(yī)療科技及資訊學系，香港

軟組織超聲印壓是利用印壓實驗來壓縮組織，然后結合超聲算出組織的厚度及形變，進而求得組織力學特性例如彈性系數(shù)的一種技術。此技術已經在生物力學中被廣泛應用于各種病變當中組織的特征化。超聲水沖印壓系統(tǒng)利用水射流來取代傳統(tǒng)固體印壓頭（一般是超聲探頭本身）的印壓作用，可以解決高頻超聲探頭前部不平整不適于用作印壓頭的缺點，并且具有快速掃描組織彈性特征的優(yōu)點，可以應用在評估很薄的組織例如關節(jié)軟骨上。本文描述一個小型化的超聲水沖印壓系統(tǒng)，并且評估它在定量軟骨質量檢測當中的作用。我們用一個硬度系數(shù)來描述軟骨的硬度，用兩組蛋白酶——胰蛋白酶和膠原蛋白酶消化分解軟骨來模擬軟骨質量的退化。初步結果（14個離體軟骨樣本，每組各7個）顯示在經過胰蛋白酶消化之后，軟骨的硬度系數(shù)從原來的(9927±3420) kPa（均值±方差，下同）降到了(2061±721) kPa（p ＜ 0.001，配對t檢驗，下同）；經過膠原蛋白酶消化之后，從(8275±3209) kPa減到了(3746±916) kPa（p＝0.001）。結合高頻超聲，此系統(tǒng)還可以測量軟骨的形態(tài)學參數(shù)和聲學特性參數(shù)。因此本研究結果顯示超聲水沖印壓系統(tǒng)能很好的評估軟骨在經過蛋白酶消化之后的各種參數(shù)變化。文章最后還討論了此系統(tǒng)的進一步改進使其能逐步真正應用于臨床活體軟骨試驗。

軟骨；骨關節(jié)炎；胰蛋白酶；膠原蛋白酶；力學特性；超聲印壓系統(tǒng)；水射流；內窺鏡

印壓實驗是用于測量軟組織力學特性的最常用的方法之一[1]。通過內窺鏡操作的印壓實驗也可以應用在腔體組織的測試上，例如關節(jié)軟骨的力學性能[2-4]。在印壓實驗里當我們需要計算出被測組織的硬度時，其初始厚度是一個很重要的參數(shù)，特別是當它和印壓頭的大小相當?shù)臅r候[1]。然而，傳統(tǒng)的印壓實驗一般利用不同的儀器測量組織的形變和它的初始厚度，降低了操作的簡易性，也不利于開發(fā)小型緊湊的測量儀器。為了解決同時測量形變和厚度的問題，超聲印壓實驗系統(tǒng)在數(shù)十年前被提出[5]，同時也被相關內窺鏡設備研究者所采納并用于關節(jié)軟骨特性的檢測[6]。國內四川醫(yī)學科學院和重慶醫(yī)科大學的一個研究組也報導了內窺式超聲印壓系統(tǒng)方面的研究，并成功應用在心肌的被動力學特性檢測上[7-8]。在超聲印壓系統(tǒng)里面，通常超聲探頭前面的平整表面也當作印壓頭使用。為了測試某些比較薄的組織例如軟骨時，我們需要采用高頻超聲以提高其分辨率。但是當使用高頻超聲的時候，因為聚焦緣故，探頭一般是凹狀的，不適宜作為印壓頭使用。為了解決這個問題，我們研究組就提出了利用水射流來代替?zhèn)鹘y(tǒng)固體印壓頭的方法，這就是超聲水沖印壓系統(tǒng)[9]。這個新的測量系統(tǒng)及方法的可行性及在測試關節(jié)軟骨和相關軟組織時的作用已被成功論證[9-11]。

骨關節(jié)炎是常見的特別是在老年人當中更加普遍的一種關節(jié)疾病，嚴重影響病人的生活質量，發(fā)展到中后期可能會導致病人的殘疾。許多病人到后期不得不選擇進行人工關節(jié)置換，這給病人家庭及社會帶來很大的經濟負擔。骨關節(jié)炎中最重要的一個變化就是軟骨的退化，用傳統(tǒng)的X光只能檢測到晚期病變。最新研究顯示骨性關節(jié)炎疾病改善藥物在治療骨關節(jié)炎方面有很好的發(fā)展前景[12-13]，但是前提是必須盡早檢測出軟骨的退化以盡早治療。另一方面，經過手術修復后的軟骨質量也需要一個可靠的手段來評估修復的效果。經過手術修復后的軟骨表面看起來可能跟正常的一樣，但是跟正常軟骨相比質量方面例如受壓性和耐用度卻可能不是很令人滿意，這同樣也需要一種定量化的客觀手段來評估軟骨的完整度。在診斷和治療上面，微創(chuàng)手術是現(xiàn)代手術發(fā)展的方向，為使開發(fā)的儀器能進一步應用到真正的關節(jié)軟骨上，系統(tǒng)必須朝小型化方面發(fā)展以適用于微創(chuàng)手術儀器。關節(jié)內鏡是檢測關節(jié)或進行微創(chuàng)關節(jié)手術的一種有效的手段，而且正被越來越多的醫(yī)生和研究人員所使用。如果上面所述的超聲水沖印壓系統(tǒng)能夠集成在關節(jié)內鏡里面，那么將對退化性骨關節(jié)炎診斷和評估修復軟骨質量的研究方面帶來重要的契機?；谝陨纤鲈颍疚闹叵蜃x者介紹一種小型化的超聲水沖印壓系統(tǒng)的研發(fā)，首先詳細描寫其結構，然后將系統(tǒng)初步應用于離體牛軟骨樣本上面，檢測這些軟骨樣本在經過蛋白酶消化之后的硬度變化，然后跟標準力學測量儀測得的楊氏模量進行比較，以驗證此系統(tǒng)應用于軟骨檢測的可行性和可靠性。以前的眾多研究已經證明超聲亦可以用來獲得軟骨形態(tài)學和聲學參數(shù)以特征化軟骨退化[14]，因為這些參數(shù)的獲得比較直接，不會受設計太大的影響，所以本文在此方面不作贅述。

1 材料和方法

1.1 系統(tǒng)結構組成

圖1 小型化超聲水沖印壓系統(tǒng)組成

圖1顯示小型化的超聲水沖印壓系統(tǒng)的組成。探頭的主要部分由一根鋁棒組成，其長度為 11cm，直徑 12 mm。鋁棒中心是一個直徑為 3 mm 的中空通道。探頭的一側用來接駁水管，另外一側安裝了一個直徑為 3 mm 的超聲探頭，超聲探頭的中心頻率是 10 MHz。在超聲探頭的另外一側是直徑為 2 mm 的出孔，用來產生水柱，并且是發(fā)射超聲到組織和接收從組織反射回來超聲的通道。由此設計可知，實驗中水射流的直徑大概是 2 mm。

圖2 基本數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)

圖2為當前印壓系統(tǒng)的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。兩種類型的信號——超聲信號和液體壓力信號分別被數(shù)據(jù)采集卡記錄在電腦作后續(xù)處理。一個超聲脈沖發(fā)射/接收儀用來發(fā)射并接收從組織反射回來的超聲信號。該超聲信號以 500MHz的頻率被采樣，然后轉化成一定長度的A模信號，與從水壓傳感器獲得的壓強信號同步存儲到個人電腦里面。A模信號和壓強信號的同步采樣頻率可以根據(jù)具體的應用決定，本文設定為 10 Hz。一個以 C++ 編寫的專用軟件程序（“wave”）可用來采集數(shù)據(jù)和進行后續(xù)信號處理。印壓形變的計算是靠互相關的方法追蹤在印壓過程當中軟骨樣本表面信號的移動獲得，壓強信號和樣本受到的壓力信號是通過一個校準過程來完成的[9]。一個電子控制的比例閥開關用來控制水壓的大小，用來在樣本表面產生壓力，完成周期性的印壓過程。實驗中用來計算軟骨形變的水的聲速采用實驗測量值為 1470 m/s。

1.2 軟骨樣本測試

我們利用從市場獲得的離體牛髕骨軟骨樣本來進行實驗，驗證系統(tǒng)的可行性和準確性。軟骨連同下面的骨頭被切成直徑為 16 mm、厚度 10 mm 左右的柱形圓塊，然后埋在魔術鋼膠里面，硬化后固定在形狀為六邊形的金屬樣品盒里面（如圖3所示）。固定軟骨的時候讓樣本表面調整到一個水平面上，以利于印壓時與水柱垂直。本實驗測試了14個軟骨樣本，其中 7個樣本屬于胰蛋白酶消化組，另外7個屬于膠原蛋白酶消化組。胰蛋白酶主要用來消化分解軟骨里面的蛋白聚糖（對膠原蛋白也有輕微作用）[15]，膠原蛋白酶（類型2）主要用來消化分解軟骨里面的膠原蛋白[16]。實驗使用 0.25% 的胰蛋白酶 -EDTA 消化液（GIBCO，美國加州 Invitrogen 公司）和 30 單位 /mL（GIBCO，美國加州 Invitrogen 公司）的膠原蛋白酶溶液來分解處理軟骨用以模擬軟骨的退化。胰蛋白酶消化過程讓軟骨在 37℃下浸泡在溶液里面分解 4h，膠原蛋白酶消化讓軟骨在 37℃下浸泡在溶液中分解 24h。在處理之后，軟骨在 0.9% 的生理鹽水中沖洗放置最少 1.5h 后再接受測量。我們將對樣本在酶消化之前和之后的結果進行對照，實驗都在室溫（24±1）℃下進行。

實驗中，將樣品盒再次固定在一個比較穩(wěn)定的底架上面。這樣在實驗當中軟骨本身就不會移動，以免影響實驗結果。這個實驗在水槽當中進行。探頭被固定在一個可以精確上下移動的支架上面，樣本放在探頭的下方。探頭跟樣本表面之間的距離可以通過支架的上下移動來調節(jié)，本實驗設置此距離為 1 mm。本實驗水都來自普通自來水，通過比例閥開關來調節(jié)壓力的大小。一個典型印壓過程包括4 個周期，每個周期 10 s，前 5 s 壓力逐漸增大壓縮軟骨，后 5 s壓力逐漸減小釋放被壓縮的軟骨，每個周期水壓從0Pa 升到 260 kPa。經過校正，最大水壓下樣本所受壓力是0.58 N。公式 (1)定義的硬度系數(shù)可用以表達軟骨的彈性力學特征：

此公式中F 是樣本受到的壓力，d是軟骨形變，D是軟骨初始厚度，S是作用面積。本研究假設水沖力作用在水柱直徑大小的面積上也就是說水柱作用面積是直徑為2mm的圓。在求參數(shù)的時候，我們只用了加壓階段，0.05N作為預載壓力，最大形變選初始厚度的3%，第1個周期作為預壓縮，只選用了第2到第4個周期的數(shù)據(jù)用來進行F/d的回歸計算。每個軟骨測試在樣本的中心進行，重復了3次，每兩次實驗間軟骨放置在0.9%的生理鹽水里至少半個小時讓軟骨完全恢復原狀。3次實驗的平均結果代表樣本的最終硬度系數(shù)。

圖3 固定在魔術鋼膠里面的典型軟骨樣本（b）是（a）經過膠原蛋白酶消化之后的對照。

作為對照，我們還利用標準力學測試儀（Instron 5569，美國麻省 Instron 公司）來進行傳統(tǒng)的印壓實驗。實驗當中選用了跟水射流操作相似的參數(shù) ：印壓頭直徑 2 mm，總共4 個周期的加壓、減壓過程，速度選用 1 mm/min，以 20 Hz的采樣率采集力和形變數(shù)據(jù)，選取后3個周期的上升段的最大形變?yōu)槌跏己穸?3% 的數(shù)據(jù)，最后利用公式 (2)計算軟骨的楊氏模量：

此公式中ν是泊松系數(shù)，a是印壓頭半徑（1mm），κ是一個調整比例系數(shù)，跟ν和印壓頭半徑/組織初始厚度比（a/ h）有關,可根據(jù)文獻中[1]的表格查出。F/d代表涵義跟公式(1)相同。本文采用經驗值ν=0.45作為軟骨的泊松系數(shù)，假設軟骨在印壓作用下體積基本不可壓縮。軟骨厚度根據(jù)軟骨表面反射和軟骨/骨頭交接面反射之間的傳播時間計算，軟骨聲速采用以前實驗數(shù)據(jù)1636 m/s[17]。

1.3 統(tǒng)計分析

對軟骨厚度和硬度系數(shù)用配對t檢驗對比消化之前和之后的結果，用 Pearson 相關系數(shù)分析水沖印壓系統(tǒng)獲得的硬度系數(shù)和標準印壓測試獲得的楊氏模量之間的相關性。用 SPSS 軟件（15.0 版本，美國芝加哥 SPSS 公司）完成統(tǒng)計分析，檢測后以 p ＜ 0.05 作為臨界點用來判斷參數(shù)是否具有顯著變化。

2 實驗結果和相關討論

對于胰蛋白酶消化組，軟骨消化之前之后的平均厚度分別為 (2.38±0.57) mm 和 (2.41±0.60) mm。相對應的膠原蛋白酶消化組的數(shù)據(jù)為 (2.04±0.21) mm 和 (2.08±0.26)mm。消化前后厚度都沒有發(fā)生顯著的變化 (p＞0.05)，說明消化分解對軟骨厚度基本沒有影響。

圖4 典型印壓過程曲線（a）是印壓力和形變隨時間變化圖。（b）是印壓力和印壓形變的對應圖，只包含用來計算硬度系數(shù)的加壓部分數(shù)據(jù)。

典型的印壓曲線如圖4所示，印壓力和形變之間的對應關系一致，相關性很高。兩組蛋白酶消化之前和之后的硬度系數(shù)變化如圖5所示。在胰蛋白酶消化組，硬度系數(shù)從（9927±3420） kPa 降低到了（2061±721）kPa，下降幅度（消化前后差異 /消化前值）達到 77%±11%（p＜0.001）。在膠原蛋白酶消化組，硬度系數(shù)從（8275±3209）kPa 下降到了（3746±916）kPa，下降幅度為 52%±10%（p=0.001）。由此可見，胰蛋白酶的消化水解作用對軟骨的硬度影響比膠原蛋白酶對軟骨的影響較大，其中一個可能的原因就是軟骨的壓縮特性中的一部分是靠附著在蛋白聚糖上面的負電子的相斥作用構成的，而膠原蛋白對軟骨力學特性的貢獻更多體現(xiàn)在拉伸特性當中[18-19]。我們從實驗結果中發(fā)現(xiàn)軟骨的粘彈性也發(fā)生了明顯的改變，此項研究正在進行中，如果有確定性的結果將會有后續(xù)報導。硬度系數(shù)跟楊氏模量的對比結果在圖6中顯示，所有的硬度系數(shù)包括消化之前和之后的結果都包含在相關性分析中。硬度系數(shù)跟楊氏模量有一個明顯的相關性（r = 0.79，p ＜ 0.001，Pearson 相關性），說明在相似的測試環(huán)境下，水沖印壓系統(tǒng)測得的硬度系數(shù)能夠很好地反映組織的力學特性，這個結果我們在以前的仿真材料中已經得到驗證[20]。對于胰蛋白酶消化組，楊氏模量從 (958±223) kPa 降到了 (384±126) kPa ；對于膠原蛋白消化組，楊氏模量從 (1069±230) kPa 下降到了(833±183)kPa。所有楊氏模量的變化都是顯著的（p＜0.001），但是幅度相對于水沖印壓系統(tǒng)，有一些差別：對于胰蛋白酶消化組，硬度系數(shù)相對下降 (60±7)%；對于膠原蛋白酶組，下降只有 (22±8)%。水沖印壓系統(tǒng)獲得的硬度系數(shù)遠遠大于通過接觸式印壓獲得的楊氏模量，這說明在相同壓力下，水沖印壓系統(tǒng)所產生的形變遠遠小于接觸式印壓頭產生的形變，這個不同可能來源于跟軟骨的互作用的印壓頭屬性的不同，我們現(xiàn)在還不知道這兩種不同系統(tǒng)印壓的具體區(qū)別，將會在以后進行進一步研究。通過后續(xù)研究，希望可以在同一種材料上面，從兩個系統(tǒng)拿到一個完全可以比較的反映材料力學特性的參數(shù)，例如楊氏模量。另外，對于膠原蛋白酶消化作用，這兩個系統(tǒng)測得的硬度變化有比較大的區(qū)別 (52% 對 22%)，其中的原因也有待于進一步研究。

圖5 軟骨硬度系數(shù)經過兩種蛋白酶消化前后的對照

圖6 軟骨硬度系數(shù)和楊氏模量的相關性

3 結束語和展望

本文主要介紹了一種超聲水沖印壓技術，并介紹了其小型化儀器設計過程和其在評估軟骨力學特性變化當中的應用。主要研究結果表明該系統(tǒng)設計有效，在軟骨上面測試得到的硬度系數(shù)跟標準測量結果具有很強的相關性，能準確測得軟骨在經過蛋白酶消化分解這個模擬軟骨退化的過程當中硬度的變化，具有很好的應用前景。接下來我們會結合超小型的超聲儀器，如心臟血管超聲（IVUS）探頭[21]，進一步改進本文當中小型化探頭的設計，使其能真正應用在關節(jié)內窺鏡上面。根據(jù)超聲影像獲得的軟骨形態(tài)學特性和聲學特性，再結合超聲印壓獲得的力學特性參數(shù)，我們可以定義一個反映軟骨綜合質量的參數(shù)，用以在活體上面檢測軟骨的退化程度或者修復效果。筆者相信這樣的系統(tǒng)一定可以給關節(jié)軟骨疾病的研究領域提供一個新的微創(chuàng)的、低成本的檢測方法。

致謝

作者感謝張忠偉、何俊峰在探頭機械加工和電路測試當中提供的幫助。本研究部分經費來自香港研究資助局（PolyU5354/08E）和香港理工大學（J-BB69）。

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Water-jet Ultrasound Indentation System: Its Miniaturization and Detection of Articular Cartilage Degeneration

HUANG Yan-ping, ZHENG Yong-ping
Department of Health Technology and Informatics, The Hong Kong Polytechnic University, Hong Kong, China

Ultrasound indentation, which utilizes ultrasound to extract the initial thickness and deformation of soft tissues during an indentation test, is a technique to investigate the biomechanical properties such as the elasticity of soft tissues. The water-jet ultrasound indentation further adopts a water-jet rather than a rigid indenter (normally the ultrasound transducer itself in a conventional ultrasound indentation) as a tool to indent the tissue. It solves the problem of difficulty in use when with high frequency ultrasound a non-planar tip of the transducer is used as the indenter. Furthermore, it has the advantage of a high-speed scan of the distribution of tissue elasticity and can be applied to assess small tissues such as the articular cartilage. In this paper, we described the development of a miniaturized water-jet ultrasound indentation system and evaluated its usefulness in assessing the quality of articular cartilage before and after degeneration. A stiffness ratio was used to represent the stiffness of the articular cartilage and two enzymes including trypsin and collagenase were used to digest the cartilage in order to simulate the degeneration. Preliminary results on 14 cartilage specimens (7 in each group) showed that the stiffness ratio decreased from (9927±3420) kPa to (2061±721) kPa (p＜ 0.001, paired t-test) in the trypsin treatment group, and it reduced from (8275±3209) kPa to (3746±916)kPa (p=0.001, paired t-test) in the collagenase treatment group, respectively. With the incorporation of high frequency ultrasound, this system can also be used to measure the morphological and acoustical properties of the articular cartilage. Therefore, the system can beused to assess the change of various properties of cartilage after degeneration. At the end of the paper some discussion is presented on further improvement of the system design towards its future clinical studies on articular cartilage in vivo.

articular cartilage; osteoarthritis; trypsin; collagenase; mechanical properties; ultrasound indentation system; water-jet; arthroscopy

R445.1

B

10.3969/j.issn.1674-1633.2011.01.003

1674-1633(2011)01-0008-05

2010-11-01

香港研究資助局（PolyU5354/08E）和香港理工大學（J－BB69）支持。

鄭永平，教授。

通訊作者郵箱：ypzheng@ieee．org