加減尪痹舒安對膠原誘導性關節炎大鼠癥狀及血清炎癥因子的影響

趙 穎 ，王偉鋼 ★，肖 誠

（1.中日友好醫院 國際醫療部一病區，2.中日友好醫院 科研處，北京 100029）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是以對稱性多關節炎病變為主要臨床表現的全身性自身免疫性疾病。其特點是關節滑膜的慢性炎癥、軟骨吸收、骨質破壞和骨質纖維化。RA這種以關節炎癥為主的慢性反復發作的全身性疾病，屬中醫學“痹證”范疇。本文旨在建立膠原誘導型關節炎（collagen induced arthritis，CIA）模型[1]的基礎上觀察加減尪痹舒安對CIA大鼠的治療效果，并檢測其對模型鼠血清白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）[2，3]、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）[4，5]水平的影響，以探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥品、試劑、儀器

選用160g～180g SPF級雄性Wistar大鼠 32只，由中國藥品生物制品檢定所提供，動物許可證號：SCXK（京）（2008-0005）。 在中日友好醫院 SPF級動物室喂養，實驗動物室許可證號：SYXK（京）（2005-0025）。

甲氨喋呤（methotrexate，MTX）：上海醫藥（集團）有限公司信誼制藥總廠生產，批號060502，用無菌蒸餾水制成水藥液，濃度為0.1mg/ml。

加減尪痹舒安的制備：川斷12g、補骨脂9g、炒黃柏 9g、地骨皮 9g、知母 12g、骨碎補 9g、赤白芍各 9g、秦艽20g、威靈仙 12g、制乳香 6g、制沒藥6g、忍冬藤20g、絡石藤20g、桑寄生20g、蠶砂10g、地鱉蟲 6g、懷牛膝 9g、青風藤 15g、生熟地各6g，共含生藥 234g，水煎過濾，濃縮至 90ml，生藥濃度2.6g/ml。4℃儲存備用。

實驗試劑有牛Ⅱ型膠原（sigma公司產品）；弗氏不完全佐劑 （Freund’s Adjuvant incomplete，sigma公司產品）；醋酸（北京現代東方精細化學品有限公司產品）；10%中性福爾馬林 （北京現代東方精細化學品有限公司產品）；EDTA緩沖液 （北京現代東方精細化學品有限公司產品）；IL-1β、TNF-α放免試劑盒（華英生物有限公司產品）。

實驗儀器：低溫冷凍離心機（北京醫用離心機廠）、顯微鏡 OlympusBX-60（日本）、電子天平（1/1000，A2000S）德國產。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥方法

健康清潔級雄性Wistar大鼠32只，適應性喂養3d后，隨機分為4組。正常對照組、CIA模型組、加減尪痹舒安組和MTX組。

實驗前1d用牛Ⅱ型膠原溶于0.1mol/L醋酸中，4℃冰箱過夜，按2mg/ml比例與弗氏不完全佐劑1∶1充分混和乳化。取適量牛Ⅱ型膠原溶液（濃度2mg/ml）逐滴加入至等容積的不完全弗氏佐劑中，牛Ⅱ型膠原終濃度為1mg/ml。冰浴中用勻漿器充分乳化，以滴入水中不擴散為度，取乳化后的混合物按0.2ml（即200μg牛Ⅱ型膠原）/只，于尾根部皮下注射。7d后按0.1ml（即100μg牛Ⅱ型膠原）/只，于尾根部皮下加強免疫1次。

正常對照組和CIA模型組均消毒飲用水灌胃，3ml/次，Qd，連續49d。加減尪痹舒安組以加減尪痹舒安煎液灌胃，3ml/次，Qd，連續49d。相當于39g/kg/d。MTX組：MTX藥液以1.6mg/kg/d灌胃，3ml/次，1次/周，其余每天給予飲用水，連續49d。

1.2.2 觀察指標

（1）一般行為表現：動物神態、毛色、活動情況、飲食量、大小便。（2）體重：每3d用電子天平稱量各組動物體重。（3）全身關節病變程度。按5級評分法評價，根據腫脹肢體的病變程度累及積分，計算出關節炎指數（arthritis index，AI）。 0 分：無紅腫；1分：小趾關節紅腫；2分：趾關節及足跖腫脹；3分：踝關節以下的足爪腫脹；4分：包括踝關節在內的部分足爪腫脹。四肢關節的積分累計即為每只大鼠的 AI。 （4）IL-1β、TNF-α：末次用藥24h以后，采用質量分數為10%的水合氯醛溶液按大鼠體重以0.3ml/100g予腹腔內注射麻醉，腹主動脈抽血4～6ml，室溫靜置30min后2500r/min離心15min，用吸液管取血清，置于凍存管-20℃冰箱待測。放射酶聯免疫學方法測定血清IL-1β、TNF-α水平。

1.3 統計學方法

采用SAS10.0軟件進行數據分析，各樣本均數間比較進行方差分析。

2 結果

2.1 一般狀態及體重變化

對照組大鼠隨著飼養時間的延長，體重不斷增加、活動自如、皮毛有光澤、精神狀態好，無異常狀態出現。模型組大鼠出現毛發干枯、飲食減少、精神萎靡，后期可見負重困難及關節活動障礙等。加減尪痹舒安組及MTX組大鼠的飲食情況較模型組好。

表1示，造模前4組大鼠體重無顯著性差異（均P＞0.05）；給藥49d后，CIA模型組及加減尪痹舒安組大鼠體重較正常對照組顯著減輕 （P＜0.01），加減尪痹舒安組大鼠體重增加與模型組相比存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 關節炎指數評分變化

造模后正常對照組為0，CIA模型組為9.12±2.73， 加減尪痹舒安組 6.34±3.71，MTX組 6.11±3.69。用藥組與模型、對照組相比均無顯著性差異（均 P＞0.05），但有改善趨勢。

2.3 各組血清IL-1β、TNF-α 水平

表2示，模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α值與其余各組相比均顯著升高（均P＜0.01）；用藥組與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。MTX、加減尪痹舒安有降低CIA大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量的作用，能夠減輕大鼠的足爪腫脹。

表2 各組血清IL-1β、TNF-α 水平（n=8）

3 討論

RA屬于中醫學“痹癥”范疇。中醫對其治療原則包括清熱化濕通絡活血、補腎強筋。現代藥理研究表明此類中藥具有抗炎免疫，抗血小板聚集，促進成骨細胞、抑制破骨細胞功能，可提高下丘腦-垂體-性腺軸的功能，調節性激素水平，符合現代醫學理論。

尪痹病名是焦樹德教授于80年代提出的，逐步得到中醫界認可。補腎祛寒治尪湯系列方在臨床上取得了良好效果，其尪痹舒安方是以補腎清熱治尪湯為主加減，動物實驗藥效學顯示其具有消腫抗炎止痛作用。加減尪痹舒安的組方是根據焦樹德教授治療尪痹（RA）的補腎清熱治尪湯化裁而來，是針對腎虛標熱重證，臨床多見于類風濕關節炎的急性期。其治療原則是補腎清熱、化濕疏風、活血通絡。以朱丹溪的潛行散及焦老自擬的清熱散痹湯加補腎強骨之品組合而成，臨床應用取得了較好的效果。同時符合現代藥理研究，川斷、補骨脂、炒黃柏、地骨皮、知母、赤白芍、秦艽、青風藤、生熟地具有抗炎免疫作用，補骨脂、杜仲、牛膝、骨碎補具有抑制破骨細胞活性促進成骨細胞增殖作用。

Ⅱ型膠原是目前較為公認的關節軟骨特異性抗原。CIA動物模型是Trentham等在1977年首次建立的實驗性關節炎動物模型，所用的抗原是將純化的天然膠原溶于醋酸制成濃度1mg/ml的溶液，與等量的弗氏佐劑或不完全佐劑混合成穩定的乳劑[6，7]。大量研究表明，CIA模型在臨床癥狀病理表現方面都與RA極為相似。CIA模型已成為研究RA常用的實驗動物模型[8～10]。

RA滑膜細胞及滑膜組織中浸潤的單核/巨噬細胞、淋巴細胞等產生大量的細胞因子，這些細胞因子通過作用于多種細胞并相互調節，形成一個復雜的網絡，促進了RA的發生和發展。而其中一些炎性細胞因子如 TNF-α、IL-1、IL-15、IL-18、IL-6、IL-12和IL-17等在RA滑膜病變中起核心作用，所以本實驗選取了IL-1β、TNF-α這2個指標。

本實驗結果示：加減尪痹舒安能減輕大鼠的足爪腫脹，改善癥狀和體征，其可能的作用機制為降低大鼠血清IL-1β、TNF-α水平，具體機理還有待于進一步研究。

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