STAT2，STAT3，IL12RB2，JAK2基因與強直性脊柱炎患病風險的關聯研究

張玉榮 張建佚 周 林 宋玉國 張吉林

朱小泉1 楊 帆1，2 黃慈波1 霍正浩2 楊 澤1

強直性脊柱炎屬于風濕病范疇，累及多個器官、多個系統，病情復雜，致殘率極高，嚴重影響患者的身心健康，并給個人、家庭和社會帶來沉重的負擔。強直性脊柱炎常見于(16～30)歲的青年人，40歲以后首次發病者少見，約占3.3%。該病的發病率國內為0.3% ～0.4%，國外總體人群發病率為0.1% ～0.2%［1］。因而強直性脊柱炎并不是一種少見的疾病，且以年輕男性多見，必須引起高度重視。對于強直性脊柱炎動物模型的研究，證明了遺傳因素和環境因素共同參與了強直性脊柱炎的發病。遺傳學的相關研究又表明多種炎癥因子與強直性脊柱炎的發病密切相關，例如HLA27，TNF2α，MMP3，IL21等［2］。從免疫因子信號傳導通路中尋找強直性脊柱炎的致病原因已經成為一種重要的研究方法。STAT2，STAT3，IL12RB2，JAK2基因存在于細胞因子IL-12通路上，IL-12通路是細胞免疫的重要因子，能調節Th1/Th2細胞免疫應答的平衡。

因此本文從細胞因子IL-12通路上選取STAT2，STAT3，IL12RB2，JAK2這4個基因，并進一步選取這些基因中的6個位點，從遺傳學角度展開研究，進行這些位點與強直性脊柱炎的關聯分析，以增加大家對強直性脊柱炎的了解。

1.材料與方法

1.1 材料 吉林漢族人群的48名患者來自北華大學附屬醫院檢驗中心，所有病例均經病理組織學確證。55名正常對照為來自吉林地區的無血緣關系的健康正常人群。所有研究對象采集靜脈血5ml，并簽署有知情同意。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及PCR反應條件 應用HRM小擴增子法進行基因分型時，雜合型主要依據熔解曲線形狀，而純合型則是依據Tm值的不同，所以擴增片段要盡量小，這樣有助于擴大純合型樣本間Tm值的差異。引物、探針序列采用Primer Premier 5.0軟件及Light Scanner Primer Design software完成，高溫內參與低溫內參依據文獻合成。各SNP基因分型所用方法、引物序列和退火溫度、退火時間和延伸時間(見表1)。其中SNPrs10758669、SNPrs744166是采用PCR-RFLP方法，所用限制性內切酶分別為:BsaJI、AluI;各酶的酶切情況是338bp→288bp和50bp，247bp→218bp和29bp;其余的SNPs采用HRM-小擴增子法。限制性內切酶BsaJI、AluI的酶切溫度分別為55℃、37℃，BsaJI酶切時間為3～4小時，AluI的酶切時間大約(7～8)小時。

表1 6個SNPs PCR擴增條件

1.2.2 產物測序 PCR產物送上海生工技術有限公司及北京天一輝遠公司進行測序，以驗證分型的準確性，做好質量控制，只列舉部分SNPs測序結果說明。

1.3 統計學方法 對照人群Hardy-Weinberg平衡采用(卡方擬和優度檢驗。相對風險用比數比(odd ratio，OR)值及其95%可信區間(95%CI)來評價。用直接計數法計算等位基因及基因型頻率，各組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗差異的顯著性水平(檢驗水準為α=0.05)。用SPSS 16.0軟件建立數據庫完成相關統計分析。采用SHEsis進行單倍型分析。應用MDR進行基因交互作用分析。

2.結果

2.1 STAT2基因(rs2066808，C;rs2066807，G)，STAT3 基因(rs744166，C)，IL12RB2 基因(rs3790567，A;rs3790568，A)和JAK2基因(rs10758669，A)的風險等位基因及其基因型頻率 以Hardy-Weinberg平衡法檢驗病例組與正常對照組的基因型頻率的分布，除了rs2066808(P＜0.05)，其他均具有群體代表性(P＞0.05)。STAT2基因(rs2066807，G)，STAT3基因(rs744166，C)，IL12RB2 基因(rs3790567，A;vrs3790568，A)和JAK2基因(rs10758669，A)與強直性脊柱炎關聯分析顯示各基因的風險等位基因和基因型頻率在病例組和對照組間的分布差異無顯著性(P＞0.05)。

圖1 SNP rs3790567 CG型測序圖

圖2 SNP rs3790567 GA型測序圖

圖3 SNP rs3790567 AA型測序圖

表2 6個SNPs的風險等位基因和基因型頻率

表3 單倍型分析結果

2.2 單倍型分析

2.2.1 IL12RB2基因上rs3790567，rs3790568的單倍型分析 IL12RB2基因上rs3790567，rs3790568單倍型分析的總r2為4.090，P-exact值為0.130。由表3可以看出P值均大于0.05，無統計學意義。

2.2.2 采用 MDR分析 STAT2基因(rs2066807，G)，STAT3基因(rs744166，C)，IL12RB2 基因(rs3790567，A;rs3790568，A)和JAK2基因(rs10758669，A)的5個多態性位點的交互作用 MDR分析的最佳模型包含了 rs2066807，rs3790567，rs744166，rs107586669這4個位點(如圖4所示)，圖中空白表明該基因型空缺。模型的P＜0.0001，交叉驗證一致性為10/10，檢驗樣本的準確度為 0.7032，結果提示STAT2，STAT3，IL12RB2和JAK2基因之間可能存在基因-基因交互作用。樹狀圖顯示rs744166和rs107586669作用比較強烈。節點圖顯示，只有STAT3(rs744166，C)與其他三個基因都具有協同作用，而其他三個基因都各有與其拮抗的基因。其中STAT3與JAK2基因之間距離更短，協同百分數最高，有最強的協同作用。

圖4 STAT2(rs2066807)，STAT3(rs744166)，IL12RB2(rs3780567)和JAK2(rs10758669)基因交互作用

圖5 STAT2(rs2066807，G)，STAT3(rs744166，C)，IL12RB2(rs3790567，A)和 JAK2(rs10758669，A)交互作用樹狀圖、節點圖

3.討論

強直性脊柱炎是一種自身免疫性疾病，其病因未明。強直性脊柱炎的發病與多種因素相關，其中基因遺傳是非常重要的因素，因此本文對細胞因子IL12通路上STAT2基因(rs2066808，C;rs2066807，G)，STAT3 基因(rs744166，C)，IL12RB2基因(rs3790567，A;rs3790568，A)和 JAK2 基因(rs10758669，A)展開研究，研究其與AS的關聯性，及這些基因之間的交互作用。

IL-12是最強的促炎癥因子之一，它由35kDa和40kDa的兩條鏈構成，其中35kDa的鏈編碼IL12A，40kDa的鏈編碼IL12B［3］。IL12來自于外周血T細胞和自然殺傷細胞，能夠直接刺激干擾素γ(IFNγ)，腫瘤壞死因子(TNFα)以及IL12的產生，提高自然殺傷細胞溶解酶的活性，促進有活性的自然殺傷細胞和T細胞(CD4+和CD8+)擴增。通過這些功能，IL12促進產生最為常見的Ⅰ型T細胞反應。通過IFNγ，IL12能夠抑制血管再生［4］。J M Pe＇ron曾經臨床實驗性的使用IL12用來治療腫瘤，試驗的結果顯示在一些病例中IL12可以使腫瘤衰退。STAT3作為JAK2的靶蛋白，正常情況下位于細胞漿內。當JA K2被激活后，信號經JAK2/STAT3通路傳導，使STAT3磷酸化而活化，即p2STAT3表達增加，然后轉入核內，與靶基因啟動子結合，誘導基因表達，轉錄合成效應底物［4］。Bromberg認為STAT3在細胞的增值和生存方面扮演了重要角色［5］。有文獻報道，心肌缺血缺氧及再灌注等可以作為應激原刺激多種細胞因子產生，激活JAK2，啟動JAK2/STAT3信號通路，介導心肌保護作用［6～8］。然而與AS相關的報道，不是很多。

總之，AS是一個微效基因參與發病機制的多基因病。文中rs2066808位點Hardy-Weinberg平衡檢驗不平衡，估計是樣本太少，不具有群體代表意義。STAT2基因(rs2066807，G)，STAT3 基因(rs744166，C)，IL12RB2 基因(rs3790567，A;rs3790568，A)和JAK2基因(rs10758669，A)關聯分析顯示各基因的風險等位基因和基因型頻率在病例組和對照組間的分布差異無顯著性(P＞0.05)。樹狀圖顯示 rs744166和rs107586669作用比較強烈。對于中國人群的AS研究仍然需要在一個大的樣本中進一步驗證。

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