Mito-KATP在七氟醚延遲預處理減輕大鼠心肌缺血再灌注氧化損傷中的作用*

肖艷英 常業恬 冉 珂 李雙鳳

研究認為，過多氧自由基生成和氧化還原系統平衡被破壞是心肌缺血再灌注損傷的重要機制，吸入麻醉藥預處理的早期心肌保護作用與其增加抗氧化酶的活性有關[1]。谷胱甘肽硫轉移酶Mu（gluta?thione S-Transferase Mu，GSTM)是抗氧化系統的重要成員。近年來的研究證實GSTM能夠抑制心肌蘭尼堿受體鈣離子釋放通道（ryanodine receptor Ca2+release channel，RyR），減少鈣離子釋放，可能是減少心肌缺血再灌注后鈣超載的因素[2-3]。線粒體三磷酸腺苷敏感性鉀通道（mito-KATP）在吸入麻醉藥預處理產生的心肌保護中發揮重要作用[4]。本研究旨在觀察七氟醚延遲預處理對大鼠心肌缺血再灌注的抗氧化作用以及抗氧化酶GSTM的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年雄性SD大鼠60只，9～10周齡，體質量250～300 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，飼養于我院實驗動物中心。按照隨機數字法分為5組，每組12只：假手術組（Sham組）開胸但不結扎左冠狀動脈；缺血再灌注組（IR組）阻斷左冠狀動脈前降支30 min，再灌注120 min；七氟醚預處理組（SPC組）心肌缺血前24 h吸入2.5%七氟醚1 h；七氟醚預處理+mito-KATP特異性阻斷劑5-羥基癸酸（5-HD）組（SPC+5-HD組），七氟醚預處理前10 min經尾靜脈給予mito-KATP特異性阻斷劑5-HD（5 mg/kg）；5-HD組，心肌缺血前24 h給予5-HD。

1.2 主要試劑與儀器 大鼠心肌肌鈣蛋白I（cTnI）檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司），GSTM多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，5-羥基癸酸(美國Sigma 公司)，七氟醚(美國Abbott公司)，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽硫轉移酶（GST）檢測試劑盒（南京建成生物醫學工程研究所），七氟醚揮發罐和氣體監測儀（美國Datex-Ohmeda公司），Western blot電泳和電轉儀設備(美國Bio Rad公司)。

1.3 造模 操作參照參考文獻[1]，SPC組和SPC+5-HD組大鼠放置于有機玻璃箱中保留自主呼吸，吸入2.5%七氟醚1 h，出氣口連接麻醉氣體監測儀監測出口氣體七氟醚、O2及CO2的濃度。Sham組，IR組和5-HD組給予純氧吸入。采用參考文獻[5]的方法，結扎左冠狀動脈前降支30 min后，再灌注120 min建立大鼠在體心肌缺血再灌注模型。于胸骨左緣3～4肋間開胸，結扎左冠狀動脈前降支，Ⅱ導聯心電圖出現ST段抬高或者心尖發紺被認為結扎成功。30 min后松開結扎線再灌注120 min，以出現ST段回落1/2以上或者左室反應性充血為再灌注成功標志。MD3000型生物信號采集系統連續監測心率（HR）、平均動脈壓（MAP）和Ⅱ導聯心電圖。

1.4 心肌梗死面積測定 每組6只大鼠用于確定梗死面積，灌注末再次結扎左冠狀動脈，經尾靜脈給予1%伊文思藍2 mL確定心肌缺血危險區域。修剪留取左室沿心臟橫軸切成1.5 mm厚左右切片，氯化三苯四氮唑（TTC）染色后拍照，采用Image pro plus 6.0專業分析軟件分析測量左室面積（LV），危險區域面積（AAR）和梗死面積（IS），計算危險區域（AAR/LV）和梗死區域百分比（IS/AAR）。

1.5 血清cTnI檢測 再灌注結束后留取頸動脈血1 mL，4℃相對離心力（RCF）1 800×g（3 000 r/min）離心15 min后取上清液，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒檢測血清cTnI水平。

1.6 心肌MDA、Ca2+含量和SOD、GST活性檢測 硫代巴比妥酸法測定MDA，甲基麝香草酚藍比色法測定心肌內鈣離子含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。按照文獻[6]的方法,根據GST對經典底物1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）的結合活性，以每分鐘每毫克心肌消耗CDNB的摩爾數來表示心肌中GST的活性（nmolCDNB·mg-·1min-1）。按照MDA、SOD、GST試劑盒說明書配制試劑，測定各管光密度，Bio-Rad法檢測蛋白含量。根據公式計算心肌組織中MDA、SOD、GST含量。

1.7 Western blot檢測心肌GSTM表達 再灌注結束剪取左室提取心肌蛋白，于12%SDS-PAGE凝膠上電泳，電轉印至PVDF膜，封閉2 h后，按照1∶500稀釋比例加入一抗GSTM抗體，放置過夜，按照1∶1 000稀釋比例加入辣根過氧化物酶標記的二抗IgG，進行化學發光反應，掃描后應用Gel pro4.0凝膠光密度分析軟件進行分析。以Sham組為參照（100%），各組心肌GSTM含量以與Sham組比較相對表達量表示。

1.8 統計學處理 采用SPSS 13.0統計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組AAR/LV、IS/AAR及cTnI比較 IR組IS/AAR和血清cTnI水平較Sham組明顯增加；SPC組IS/AAR和血清cTnI水平較IR組減少；SPC+5-HD組IS/AAR和血清cTnI水平較SPC組增加，差異均有統計學意義（P<0.01），5-HD組各項指標與IR組及SPC+5-HD組差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 各組大鼠心肌MDA、Ca2+含量、SOD、GST活性及心肌GSTM表達比較 IR組心肌MDA含量和Ca2+濃度較Sham組增加，而SOD和GST活性降低（P<0.01）；SPC組較IR組減少了心肌MDA含量和Ca2+聚集，增加了SOD和GST活性（P<0.01）；SPC+5-HD組較SPC組心肌MDA含量和Ca2+濃度增加，而SOD和GST活性降低（P<0.01）。SPC組較IR組心肌GSTM表達增加，而SPC+5-HD組較SPC組心肌GSTM降低（P<0.01），5-HD組各項指標與IR組及SPC+5-HD組比較差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

3 討論

心肌IR臨床常見，氧化應激和鈣超載被認為是其重要機制。再灌注后氧自由基大量生成,與細胞膜的不飽和脂肪酸結合生成脂質過氧化物,引起膜通透性改變和膜蛋白的脂質微環境改變，加重細胞內鈣超載[1]。機體內有SOD和谷胱甘肽代謝酶系統2個重要的抗氧化系統，SOD能夠清除多余的超氧陰離子，而后者是一系列氧自由基生成的啟動環節；GST是谷胱甘肽代謝酶系統的重要成員，能催化脂質過氧化物與谷胱甘肽結合而消除脂質過氧化物[6]。MDA是脂質過氧化的代謝產物，可作為判斷細胞氧化應激損傷程度的指標之一[6]。因此，本研究中選擇Ca2和MDA作為判斷氧化損傷指標，SOD和GST活性作為抗氧化能力指標。有研究顯示七氟醚早期相預處理能夠增加SOD活性，減少MDA產生，減少心肌梗死面積和改善心功能[1]。本研究中各缺血組心肌缺血危險區域（AAR/LV）在一個相似的范圍，表明模型建立成功。七氟醚延遲預處理也能減少缺血再灌注后梗死面積、血清cTnI釋放，增加了SOD和GST的活性，表明七氟醚延遲預處理也能夠減輕氧化損傷。

表1 各組AAR/LV、IS/AAR及血清cTnI比較（n=6±s）

表1 各組AAR/LV、IS/AAR及血清cTnI比較（n=6±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別Sham組（1）IR組（2）SPC組（3）SPC+5-HD組（4）5-HD組（5）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）（2）：（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）（4）∶（5）AAR/LV（%）0 41±7 42±8 39±6 37±5 51.2**16.33**16.71**15.72**14.99**0.38 0.61 1.34 0.99 1.72 0.73 IS/AAR（%）0 40±8 20±4 42±2 37±3 89.9**21.43**10.61**22.27**19.62**10.81**0.85 1.81 11.66**9.01**2.65 cTnI（μg/L）4.9±0.6 50.2±7.5 24.9±3.1 44.7±7.6 53.2±10.1 52.4**16.12**7.00**14.31**16.97**9.11**1.81 0.85 7.31**9.97**2.66

表2 各組大鼠心肌MDA、Ca2+含量、SOD、GST活性和GSTM表達比較 （n=6±s）

表2 各組大鼠心肌MDA、Ca2+含量、SOD、GST活性和GSTM表達比較 （n=6±s）

*P<0.05，**P<0.01

Sham組（1）IR組（2）SPC組（3）SPC+5-HD（4）5-HD組（5）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）：（3）（2）∶（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）（4）∶（5）Ca2+（nmol/g）5.4±0.7 8.9±0.7 6.6±0.4 8.6±0.6 8.3±0.5 40.2**14.64**4.96**13.48**12.37**9.68**1.16 2.26 8.52**7.41**1.10 MDA（nmol/mg）3.2±0.6 18.2±3.4 11.9±2.4 20.7±3.8 19.4±1.4 46.2**14.04**8.18**16.41**15.19**5.86**2.37 1.15 8.24**7.01**1.23 SOD（U/mg）185.7±23.6 101.0±19.7 140.9±16.5 102.9±12.5 97.7±14.6 27.4**11.77**6.24**11.29**12.24**5.53**0.47 0.48 5.05**6.00**0.95 GST（nmol CDNB·mg-1·min-1）868.7±58.4 539.1±59.0 659.2±31.3 527.2±89.0 530.3±62.1 33.0**12.88**8.19**13.34**13.23**4.69**0.47 0.35 5.16**5.04**0.12 GSTM（%）100 48.1±8.7 83.3±10.5 44.3±14.7 47.4±7.0 42.9**13.39**4.31**14.35**13.55**9.08**0.96 0.17 10.03**9.24**0.79組別

研究顯示延遲預處理的心肌保護作用與基因激活和保護性蛋白質合成有關，抗氧化酶被認為是潛在的心肌保護性蛋白[4,6]。有研究認為SOD在多種形式延遲相預處理（包括熱適應，低溫，缺血預適應等）后表達增加[4]。Dikmen等[6]發現在七氟醚預處理后3 d不僅能增加SOD表達，也能增加GST表達，認為GST可能也是一種保護蛋白。GST具有多種同工酶，不同的同工酶在組織內表達有差異，其中Mu類GST（GSTM）在心肌大量表達[2]。本研究結果表明七氟醚延遲預處理能增加GSTM表達，考慮可能七氟醚心肌保護作用與GSTM表達增加有關。近年來研究認為GSTM不僅僅是谷胱甘肽代謝酶系統重要成分，而且可以與蘭尼堿受體鈣離子釋放通道（RyR）結合，其中亞型GSTM2-2能特異性抑制心臟的RyR2的活性，抑制心肌肌漿網的鈣離子釋放[3]。缺血再灌注中鈣超載和過量的氧自由基互相影響和促進，氧自由基使細胞膜結構破壞，對Ca2+通透性增加,加重細胞內鈣超載；細胞內鈣超載激活鈣敏感蛋白水解酶以及鈣依賴性磷脂酶，是形成大量活性氧的來源[5]。GSTM的作用可能與其抗氧化作用以及抑制鈣離子釋放有關。

mito-KATP是線粒體上一類特殊的內向整流鉀離子通道。大量的研究認為mito-KATP在吸入麻醉藥預處理的心肌保護機制中起重要作用[4]。有學者認為吸入麻醉藥預處理引起mito-KATP開放的機制是患者吸入麻醉藥后，激活細胞內復雜的蛋白激酶信號通路，通過PKC-ε轉位于線粒體內膜而使mi?to-KATP開放[4]。但是也有學者認為吸入麻醉藥可以自由通過細胞膜和線粒體膜，直接作用于線粒體膜上的mito-KATP，促使其開放[7]。Mito-KATP開放后引起線粒體膜電位短暫的去極化和線粒體呼吸脫偶聯，產生少量的活性氧（ROS）；而ROS的產生也可以促使mito-KATP開放，形成正反饋，促使預處理信號的不斷傳遞和放大[7]。ROS的產生亦可以作為細胞內信號分子，激活細胞內信號轉導途徑以及心肌保護相關基因轉錄。本研究中在七氟醚預處理前給予5-HD取消七氟醚心肌保護作用，可能是5-HD阻斷了預處理信號通過mito-KATP向下游傳遞，提示mito-KATP在吸入麻醉藥延遲預處理心肌保護作用通路中重要作用。

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