高氧環境下肺成纖維細胞RB蛋白磷酸化狀態的改變*

趙詩萌 魏 兵 吳紅敏 薛辛東

早產兒慢性肺疾病（chronic lung disease，CLD）是早產兒長時間吸入高濃度氧后最常見的并發癥，其晚期病理結局是肺間質纖維化，表現為肺成纖維細胞（lung fibrolast，LF）的過度增殖[1]。G1/S是細胞周期的關鍵性調控點，高氧通過抑制G1/S調控點的作用，促使LF更多地從G1期進入S期，導致LF過度增殖[2]。RB基因是G1/S調控點的核心，有磷酸化及非磷酸化2種形式，其中RB磷酸化的RB蛋白可能參與對細胞增殖的負調控作用。本研究的主要目的是通過檢測CLD鼠不同發展階段LF總RB蛋白及磷酸化RB蛋白的表達,探討RB基因在CLD鼠肺間質纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年雌性SD大鼠60只，成年雄性SD大鼠15只，清潔級，體質量220～240 g，購自中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物部，雌雄交配（4∶1）。將孕22～23 d自然分娩的新生SD大鼠共120只（連同母鼠）隨機分為空氣對照組和高氧組，每組60只新生鼠及30只母鼠。高氧組于生后12 h內置于玻璃氧箱（60 cm×50 cm×40 cm）中，持續輸入氧氣，維持吸入氣體氧濃度（FiO2）體積分數在0.85，用鈉石灰吸收CO2，使其體積分數為0.005。溫度22℃～25℃，濕度50%～70%，每天定時開箱30 min，添加水、飼料及更換墊料，并與空氣組交換母鼠以免因氧中毒而導致喂養能力下降。空氣組置于同一室內空氣中（FiO2的體積分數為0.21），飼養條件與高氧組相同。

1.2 實驗方法

1.2.1 肺成纖維細胞原代培養 分別于實驗后3、7、14、21 d隨機處死動物后，無菌條件下采集肺組織，進行LF細胞的原代培養[3]。待細胞鋪滿瓶底后按1∶2傳代，收集第3代細胞用于實驗[3]。

1.2.2 免疫組化技術檢測總RB及磷酸化RB蛋白表達 取同代細胞接種于蓋玻片上，第2天取出蓋玻片用4%多聚甲醛固定。按免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）步驟操作，一抗分別為兔RB單克隆抗體（美國NEO?MARKERS公司）、羊抗人p-RB絲氨酸（ser）-795多克隆抗體（Santa Cruz公司產品），DAB顯色。顯微鏡下觀察并拍片，每組動物各時間點培養的LF免疫組化爬片隨機抽取10張，每張片子于光鏡（×400）隨機取5個視野，蛋白質半定量測定應用美國Universal Imaging Porporation圖像分析系統，應用Me?ta Morph軟件分析陽性細胞的著色強度，以平均積分光密度值表示RB及p-RB產物的強度。

1.3 統計學分析 所有數值均采用SPSS 11.5統計軟件分析，數據用±s表示，兩樣本均數比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺成纖維細胞RB蛋白免疫組化結果 高氧組與空氣組相比，各時點RB蛋白的表達差異無統計學意義（P>0.05），見表1、圖1。

表1 2組肺成纖維細胞RB免疫組化光密度值比較（n=10±s）

表1 2組肺成纖維細胞RB免疫組化光密度值比較（n=10±s）

均P>0.05

組別空氣組高氧組t 3 d 0.256±0.014 0.249±0.021 0.83 7 d 0.250±0.024 0.261±0.022 1.01 14 d 0.257±0.027 0.266±0.033 0.63 21 d 0.256±0.020 0.261±0.037 0.16

2.2 肺成纖維細胞p-RB蛋白免疫組化結果 生后3 d時2組p-RB蛋白的表達差異無統計學意義（P>0.05）,生后7～21 d時高氧組表達開始增多，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01），見表2、圖2。

表2 2組肺成纖維細胞p-RB光密度值比較（n=10±s）

表2 2組肺成纖維細胞p-RB光密度值比較（n=10±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別空氣組高氧組t 3 d 0.089±0.002 0.092±0.005 1.67 7 d 0.095±0.006 0.102±0.004 2.91*14 d 0.089±0.005 0.104±0.008 4.77**21 d 0.091±0.006 0.110±0.007 6.19**

3 討論

真核細胞分裂增殖必須通過2個關鍵的細胞周期調控點：G1/S和G2/M關卡調控點。目前對G1/S調控點途徑研究得較為深入，RB蛋白是該調控點的中心。現已證實，在多種腫瘤中均可見RB蛋白的表達異常[4]，其原因一方面可能與RB蛋白自身變異有關,另一方面也可能是由于細胞周期素依賴激酶的抑制因子,如p16Ink4a的去活化促進RB的磷酸化而失活。

Rb基因主要以分子質量為110 ku的非磷酸化形式和分子質量介于110～116 ku的不同程度的磷酸化形式存在，RB蛋白功能的發揮依賴激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化調節實現的，其以磷酸化和去磷酸化的形式決定著轉錄因子E2F的活性，在細胞周期調控中處于中心環節，從而控制著細胞的生長和分化[5]。低磷酸化或非磷酸化的RB，可以結合并抑制E2F轉錄因子，阻止細胞由G1期進入S期，從而抑制細胞增殖。RB蛋白共含有16個細胞周期素依賴性激酶的磷酸化位點,Rb蛋白的功能狀態依賴于不同位點的磷酸化，其中ser-795位點磷酸化是從有活性的非磷酸化狀態向無活性的磷酸化狀態轉變的標志。ser-795可以被cyclin D1/CDK4磷酸化，由此解除了RB介導的對細胞周期的抑制[6]。

筆者前期的研究發現，高氧可導致新生鼠肺組織P16基因啟動子甲基化異常，使肺成纖維細胞P16基因表達失活[7]。而當P16蛋白低表達或不表達時，cyclin D過表達與CDK4結合，從而使RB蛋白磷酸化而導致其與轉錄因子E2F1解離，游離狀態的E2F1進入核內結合一系列具有特殊序列的基因啟動子區，促進這些基因的表達，這些基因產物促進細胞通過G1/S調控點，細胞提前進入S期，細胞生長失控。為了證實這一推論，筆者觀察和比較總RB蛋白及磷酸化RB在LF中的表達，結果發現高氧及空氣各實驗組肺成纖維細胞RB蛋白的表達均無明顯差異，說明高氧不能改變總RB蛋白的表達。與空氣組相比，生后7 d時高氧組p-RB表達開始增多，提示高氧可能通過抑制P16基因的表達，使得RB蛋白磷酸化，導致RB蛋白功能障礙,解除了RB蛋白對細胞周期的抑制，細胞過度增殖。

[1]Baraldi E,Fillipone M.Chronic lung disease after premature birth[J].N Engl J Med,2007，357(19):1946-1955.

[2]趙詩萌，吳紅敏，劉雪雁，等.CLD鼠肺成纖維細胞的原代培養及生物學行為研究[J].中國現代醫學雜志,2009,19（17）:2561-2564.

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[4]Contu SS,Contu PC,Damin DC,et al.pRB expression in esopha?gealmucosa of individuals at high risk for squamous cell carcinoma of the esophagus[J].World J Gastroenterol,2007,13(11):1728-1731.

[5]Dasgupta P,Betts V,Rastogi S，et al.Direct binding of apoptosis sig?nal-regulating kinase 1 to retinoblastoma protein:novel links be?tween apoptotic signaling and cell cycle machinery[J].J Biol Chem,2004,279(37):38762-38769.

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