葛根素聯合牛磺酸對2型糖尿病大鼠胰腺的保護作用*

門秀麗 趙利軍 孔小燕 趙 霞 李克寧 張連元

胰島β細胞功能紊亂是糖尿病的主要發生機制之一[1]。β細胞的抗氧化酶水平較機體其他組織細胞低，極易受到氧化因子的攻擊[2]。線粒體是細胞活性氧（ROS）的主要來源，同時也是ROS損傷作用的主要靶點[3]。ROS可引起胰島β細胞胰島素啟動因子胰十二指腸同源盒基因1（pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1）表達下調。研究表明，高血糖所致氧化應激可導致胰腺組織PDX-1表達下調[3]。葛根素和牛磺酸均具有一定的降血糖、抗自由基作用[4]。本研究旨在探討葛根素聯合牛磺酸對2型糖尿病大鼠胰腺的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動物：健康雄性Wistar大鼠（SPF級）50只，2個月齡，體質量180～240 g，購自北京醫科大學實驗動物中心。實驗期間動物自由飲水，攝食飼料為華北煤炭醫學院實驗動物中心提供的混合飼料（碳水化合物占總熱量的66.5%、脂肪占10.2%、蛋白占23.3%），適應性喂養1周后進行實驗。室溫18℃～28℃，相對濕度62%～80%。（2）主要儀器與試劑：鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma公司;胰島素酶聯免疫試劑盒購自美國Linco公司;糖化血紅蛋白（HbA1c）檢測采用挪威Axis-Shield（NycoCard ReaderⅡ）檢測儀，葡萄糖（Glucose）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、ROS及總蛋白定量試劑盒購自南京建成生物工程研究所，牛磺酸粉劑購自中國湖州生物化學有限公司（批號:980018），葛根素注射液購自海南斯達制藥有限公司（批號：H20023176）。PDX-1羊抗大鼠抗體購自Santa Cruz公司，抗羊二抗購自唐山灝洋生物制品公司。SIGMA-2M/ETM低溫高速離心機購自美國Sigma公司；FSH-Ⅱ高速電動勻漿器購自江蘇金壇國勝實驗儀器廠；Salzburg酶標儀，721分光光度計購自上海第三分析儀器廠。

1.2 模型制備與分組 50只大鼠給以高糖高脂飼料，持續喂養4周后，尾靜脈一次性注射STZ溶液25 mg/kg，72 h后測空腹血糖，以血糖值11.1～33.3 mmol/L為造模成功，共40只，按隨機數字表隨機分為糖尿病（DM）組、牛磺酸治療（Tau）組、葛根素治療（Pue）組和葛根素聯合牛磺酸治療（Pue+Tau）組，每組10只。Tau組大鼠腹腔注射質量濃度為20 g/L牛磺酸生理鹽水溶液，200 mg（/kg·d），Pue組大鼠腹腔注射葛根素注射液160 mg（/kg·d），Tau+Pue組大鼠腹腔先后注射等量的葛根素和牛磺酸，DM組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水溶液，持續8周。

1.3 觀察指標 末次給藥后，4組大鼠均禁食12 h尾靜脈取血測定HbA1c，從腹主動脈取血5 mL，2 000 r/min離心15 min 取血漿，按試劑盒說明書測Glucose、SOD、MDA、ROS和胰島素（Insulin）水平。

1.4 胰腺組織處理及指標測定 取血后，每組取6只大鼠剖腹分離出胰腺，沖洗，拭干，分離去脂肪，稱質量。用冷生理鹽水溶液制成100 g/L的組織勻漿，2 000 r/min離心10 min取上清液，再以11 000 r/min低溫高速離心20 min，沉淀，用冰冷生理鹽水溶液制成線粒體混懸液，線粒體在光學顯微鏡下觀察呈細沙樣，用超聲細胞粉碎儀將線粒體破碎，按試劑盒說明進行MDA、SOD及ROS測定。蛋白定量采用考馬斯亮藍法。

1.5 胰腺組織的免疫組織化學染色 處死大鼠即刻取胰尾部分進行PDX-1的免疫組織化學染色，光學顯微鏡下觀察并照相。

1.6 統計學方法 采用SPSS 10.0軟件進行分析，符合正態分布的計量數據均以±s表示，多組間比較用單因素方差分析,組間比較采用LSD-t法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血漿Glucose、Insulin及SOD等比較 Tau組、Pue組及Pue+Tau組較DM組大鼠血漿SOD活性和血漿胰島素水平均有顯著升高，而Glucose、MDA、ROS及HbA1c呈不同程度的降低，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 各組血漿葡萄糖、胰島素及SOD等指標比較±s）

表1 各組血漿葡萄糖、胰島素及SOD等指標比較±s）

*P<0.05，**P<0.01；表2同

DM組（1）Tau組（2）Pue組（3）Pue+Tau組（4）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（4）（3）∶（4）10 10 10 10 Glucose（mmol/L）24.13±5.27 17.61±3.56 16.73±4.35 12.37±1.78 106.23**0.007 0.005 0.002 0.040 0.031 Insulin（μg/L）1.07±0.12 2.21±0.33 2.58±0.51 3.68±0.49 55.33**0.008 0.006 0.040 0.030 0.040 SOD（U/L）18.38±3.33 24.35±6.37 23.12±5.94 29.51±5.17 148.56**0.030 0.040 0.006 0.040 0.040 MDA（nmol/L）6.35±0.78 5.42±1.64 4.38±0.91 3.49±0.37 61.82**0.040 0.031 0.007 0.040 0.071 ROS（U/mL）39.23±5.78 23.38±6.67 22.14±4.39 16.92±2.26 341.27**0.030 0.030 0.002 0.030 0.040 HbA1c（%）8.30±2.21 6.11±1.98 6.92±2.02 5.31±1.56 91.11**0.031 0.042 0.007 0.060 0.041 DM組（1）Tau組（2）Pue組（3）Pue+Tau組（4）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（4）（3）∶（4）10 10 10 10組別 n組別 n

2.2 各組胰腺線粒體MDA、SOD和ROS水平的比較 Tau組、Pue組及Pue+Tau組大鼠胰腺線粒體MDA和ROS水平較DM組均有不同程度的降低，而SOD活性均有顯著升高，其中Pue+Tau組這種變化更加明顯，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01），見表2。

2.3 各組胰腺組織PDX-1免疫組織化學染色結果 PDX-1免疫組化陽性細胞主要位于胰腺的胰島細胞內，外分泌腺細胞未見表達，DM組大鼠胰島細胞中PDX-1表達水平較低，Tau和Pue組胰島細胞PDX-1表達上調，Pue+Tau組PDX-1表達明顯上調，見圖1～4。

表2 各組動物胰腺組織線粒體MDA、SOD和ROS比較 ±s）

表2 各組動物胰腺組織線粒體MDA、SOD和ROS比較 ±s）

組別DM組（1）Tau組（2）Pue組（3）Pue+Tau組（4）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（4）（3）∶（4）n6666 MDA（μmol/g）4.31±0.29 2.83±0.14 3.13±0.27 1.78±0.29 86.13**0.003 0.040 0.002 0.041 0.008 SOD（U/mg）0.06±0.01 0.12±0.02 0.15±0.04 0.18±0.03 35.72**0.002 0.008 0.001 0.030 0.040 ROS（U/mL）57.37±7.21 41.53±6.08 44.69±8.97 35.43±5.81 749.28**0.007 0.030 0.002 0.041 0.032

3 討論

線粒體是細胞進行生物氧化和能量轉換的主要場所，其不僅是ROS的主要來源，同時也是ROS損傷作用的主要靶點[5]。ROS可引起胰島β細胞胰島素啟動因子PDX-1表達下調。研究表明，高血糖所致氧化應激會導致胰島素啟動子蛋白PDX-1的缺失，從而引起胰島素基因表達下調，使胰島素的分泌減少、β細胞功能衰退，進一步加重了糖脂代謝紊亂；而PDX-1主要在胰島的β細胞中表達，其對胰腺的發育成熟及胰島素基因轉錄水平的調控起重要作用[3]。

本研究顯示，與DM組大鼠相比較，Pue+Tau組大鼠胰腺組織中ROS和脂質過氧化產物MDA水平明顯降低，抗氧化酶SOD活性增強，同時觀察到血漿胰島素水平增加，而血糖和糖化血紅蛋白水平降低，表明葛根素聯合牛磺酸可通過增強糖尿病大鼠胰島組織抗氧化酶的活性，加大對自由基的清除，減輕大量自由基對胰島β細胞的過氧化損傷，保護了胰島β細胞的功能。另外，糖尿病模型組大鼠胰腺PDX-1蛋白表達較弱，說明長期高血糖可以使PDX-1表達下降，并使其對于葡萄糖的反應性減弱，導致胰島素的分泌減少。而葛根素聯合牛磺酸干預可明顯上調胰島β細胞PDX-1蛋白的表達，從而促進胰島素的分泌，保護胰島細胞的功能。結合前面的實驗結果，筆者認為葛根素聯合牛磺酸可通過減輕2型糖尿病時的氧化應激反應上調PDX-1蛋白的表達，實現對糖尿病胰島β細胞的保護作用。

[1]Kavaler S，Morinaga H，Jih A，et al.Pancreatic{beta}-cell failure in obese mice with human-like CMP-Neu5Ac hydroxylase deficiency[J].FASEB J，2011，25(6):1887-1893.

[2]Drews G，Krippeit-Drews P，Düfer M.Oxidative stress and be?ta-cell dysfunction[J].Pflugers Arch，2010，460(4):703-718.

[3]Robertson R，Zhou H，Zhang T，et al.Chronic oxidative stress as a mechanism for glucose toxicity of the beta cell in type 2 diabetes[J].Cell Biochem Biophys，2007，48(2-3):139-146.

[4]張艷敏，趙利軍，孔小燕，等.牛磺酸聯合葛根素對2型糖尿病大鼠血液流變學的影響[J].中國現代醫學雜志,2010,20（14）:2115-2117.

[5]Li N，Frigerio F，Maechler P.The sensitivity of pancreatic be?ta-cells to mitochondrial injuries triggered by lipotoxicity and oxi?dative stress[J].Biochem Soc Trans，2008，36(Pt 5):930-934.