ABCA1啟動子區基因多態性與血脂水平及冠心病的關系

程愛娟 毛用敏 崔讓莊 吳尚勤 孫 姍

腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCAl）是細胞膜上一種重要膽固醇流出調節蛋白（Cholesterol effuse regulatory protein，CERP），其介導的細胞內膽固醇流出是膽固醇逆向轉運（Reverse cholesterol transportation，RCT）的起始環節，ABCAl正常表達可提高循環高密度脂蛋白（HDL）水平[1]，因此ABCAl表達水平對維持細胞內外的膽固醇平衡、調節血脂以及防止動脈粥樣硬化的發生可能具有重要意義。文獻報道，ABCA1基因突變可導致個體HDL膽固醇（HDL-C）嚴重缺乏而引發冠心病[2]。本研究針對ABCA1基因啟動子-14 bp位點基因多態性與冠心病發生及血脂水平的關系進行探討。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2007年9月—2008年5月我院心臟科住院患者428例，均為長期居住天津市、相互無親緣關系者。冠心病組228例，其中男122例，女106例，均符合中華醫學會心血管病分會提出的冠心病診斷標準。患者均經冠狀動脈造影證實主要1支血管狹窄≥50%；對照組200例，其中男113例，女87例，經冠狀動脈造影排除冠心病。2組臨床資料比較差異無統計學意義，具有可比性，見表1。

1.2 方法 晨起抽取肘正中靜脈血5 mL，EDTA抗凝，低滲溶血法提取DNA。聚合酶鏈反應（PCR）擴增引物：引物參照文獻[3]設計，由上海生工生物工程公司合成，引物序列為：上游5′-GAC TGA ACT ACA TAA ACA GAG G-3′，下游5′-CGG CCC CAC TCA CTC TCG-3′。PCR擴增體系及參數：25 μL反應體系中各物質的濃度為60 mmol/L Tris-HCl,pH 9.0，15 mmol/L（NH4）2SO4，3.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，0.4 μmol/L上游和下游引物，1 U Taq DNA聚合酶，0.5 μg DNA。PCR反應條件：95℃5 min變性，后接35個循環。95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，最后72℃延伸7 min。PCR反應結束后，在2%瓊脂糖凝膠上鑒定PCR反應結果。用限制性內切酶Bme13901酶切PCR產物，反應條件為10×Buffer 1.5 μL，Bme13901 8 U，PCR產物11 μL，H2O補足體積至15 μL，37℃孵育16 h，酶切反應液在3.5%瓊脂糖凝膠行電泳，電泳結束后用凝膠成像系統拍照。血總膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）用酶法測定，血HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇（LDH-C）用直接一步法測定。

表1 冠心病組和對照組臨床資料比較

1.3 統計學分析 采用SPSS 10.0軟件進行統計學分析。組間基因型及等位基因頻率的差別用χ2檢驗，組間及組內血脂水平比較用t檢驗，2組等位基因分布進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR擴增產物的酶切鑒定 ABCA1啟動子-14 bp C→T置換基因型PCR產物經Bme13901酶切，瓊脂糖凝膠電泳呈現3種基因型，野生型CC純合子存在Bme13901的酶切位點（CCGG）可被酶切，出現91 bp和41 bp電泳條帶，變異型TT因-14 bp位點發生C→T置換酶切位點消失，因此出現132 bp電泳條帶，CT雜合子出現132、91、41 bp共3條電泳條帶。41 bp條帶片段較小，不易看清，見圖1。

2.2 2組血脂水平的比較 冠心病組TC、TG、LDL-C水平均高于對照組，而HDL-C水平則低于對照組，差異有統計學意義，見表2。

表2 2組血脂水平比較 （mmol/L ±s）

表2 2組血脂水平比較 （mmol/L ±s）

*P<0.05

冠心病組對照組t 228 200 TC 5.96±0.73 5.18±0.42 4.937*TG 2.35±0.48 1.26±0.32 2.562*HDL-C 0.54±0.13 0.95±0.22 2.337*LDL-C 2.98±0.32 2.07±0.61 3.865*組別 n

2.3 2組基因型及等位基因頻率分布 2組基因型和等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（χ2=0.071，P>0.05）。全部檢測人群中CC型占42.99%（184/428），CT型占51.64%（221/428），TT型占5.37%（23/428）。2組間基因型及等位基因頻率分布差異均無統計學意義，見表3。

表3 2組ABCA1基因-14 bp位點基因型及等位基因頻率分布

2.4 ABCA1基因-14 bp位點不同基因型的血脂比較 對照組中T等位基因攜帶者血清中HDL-C水平明顯低于非攜帶者（P<0.05），而血清中TC、TG和LDL-C水平在2組間差異無統計學意義（P>0.05），見表4。

表4 對照組中不同ABCA1基因-14 bp位點基因型的血脂比較 （mmol/L±s）

表4 對照組中不同ABCA1基因-14 bp位點基因型的血脂比較 （mmol/L±s）

*P<0.05

基因型CC CT/TT t n 83 117 TC 5.06±0.43 5.19±0.34 0.246 TG 1.23±0.32 1.27±0.49 0.568 HDL-C 1.17±0.19 0.86±0.23 3.416*LDL-C 2.01±0.32 2.08±0.15 0.357

3 討論

ABCA1是一種重要的膽固醇流出調節蛋白，能介導細胞內膽固醇逆向轉運到細胞外，使之與載脂蛋白A（ApoA）-Ⅰ結合并包裝形成HDL的膜轉運蛋白。因此，ABCA1是調節血漿HDL及細胞內膽固醇水平的重要膜蛋白，ABCAl的表達水平與動脈粥樣硬化的發生關系密切[3]。

多種代謝酶和載脂蛋白的活性以及脂蛋白顆粒的大小改變皆與ABCA1基因突變相關，引起膽固醇逆向轉運異常[4]。ABCA1基因變異最常見方式是單核苷酸多態性（SNPs），研究熱點為R219K、R1587K、M883I等位點[5]。Tangier病即ABCAl基因突變所致[6]，該基因突變引發膽固醇流出障礙，血漿中ApoA-Ⅰ不能從外周細胞獲得膽固醇并包裝形成HDL，從而被迅速降解，繼之出現了急性冠脈綜合征（AS）和低HDL血癥等一系列病理改變，提示ABCAl基因突變可導致冠心病的發生。

最近研究表明，ABCA1基因-14 bp位點C→T基因多態性與缺血性腦卒中發生相關[7]，但其與冠心病易患性研究較少。本研究針對天津地區漢族人群進行小樣本研究，探討ABCA1基因啟動子-14 bp位點C→T基因多態性與冠心病發生及血脂的關系。冠心病組與對照組中CC、CT、TT這3種基因型頻率差異無統計學意義。由于冠心病組患者血脂水平多受降脂藥物影響，且服藥不規律，難以評價其血脂水平與基因型之間的相關性，故僅在對照組（未服用任何降脂藥物）中進行基因型和血脂水平的分析。結果顯示，對照組中T等位基因攜帶者血清中HDL-C水平明顯低于非攜帶者，但T等位基因在冠心病組和對照組間差異無統計學意義。此結果提示ABCA1基因啟動子-14 bp位點C→T突變導致HDL-C降低，但并不能證明其可導致冠心病的發生。本研究標本數量過少，且冠心病為多種危險因素協同作用。因此，仍需較大樣本進行分子生物學試驗研究以進一步闡明兩者間的內在聯系。

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