男性高尿酸血癥患者血漿代謝組學的研究*

鐘 麒 高玉霞 常 紅 王 璇 張美琳 邊姍姍 黃國偉

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是以體內嘌呤代謝紊亂、尿酸增高為特征的疾病。目前其在中老年男性中的發病率逐年升高[1]。HUA可誘發痛風、尿石癥等疾病,且血尿酸水平升高與代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）密切相關[2]。代謝組學對于了解疾病狀態時代謝譜的改變及改變的機制，尋找與疾病進展有關的代謝或代謝產物及其導致疾病進展的機制有重要價值[3]。本研究通過對HUA患者血漿代謝物的檢測，為探討HUA病因、HUA與其他MS組分的關系提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2009年12月—2010年1月和平區事業單位工作人員10例，均為男性，其中健康對照組5例，平均年齡（49.40±3.96）歲；單純HUA組5例，平均年齡（50.56±5.19）歲。2組年齡差異無統計學意義（t=0.33，P>0.05）。HUA患者血尿酸≥420 μmol/L，且不患有高血壓、高血脂、糖尿病等其他慢性非傳染性疾病[4]。

1.2 儀器與試劑 INOVA 600 MHz超導核磁共振譜儀，配備脈沖場梯度，帶梯度場的三共振探頭（美國瓦里安公司）；離心機（德國Eppendorf公司）；重水（D2O，99.9%，美國Cam?bridge Isotope Laboratories,Inc公司）；3-三甲基硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸鈉（TSP，德國Merck公司）。

1.3 樣品采集和配制 清晨空腹取靜脈血5 mL，對樣品以3 000 r/min離心10 min，取上清液（血漿）300 μL，-80℃冷凍保存。進行氫核磁共振（1H-NMR）實驗前，對樣品進行室溫下解凍，再向編號后的離心管中分別依次加入100 μL TSP的重水溶液（1 g/L），300 μL血清以及200 μL D2O。溶液充分震蕩混勻后，14 000 r/min離心10 min，取550 μL上清加入5 mm核磁共振管中待用。

1.4 NMR實驗 對每個血漿樣本分別采用弛豫編輯脈沖譜（CPMG脈沖譜）（-RD-90°-（τ-180°-τ）n-ACQ）和擴散編輯脈沖譜（LEDbpp脈沖譜）（-RD-90°-G1-180°-G1-90°-T-90°-G1-180°-G1-90°-τ-90°-ACQ）采集血漿樣本的數據，分別觀測血漿中的小分子代謝物和脂類代謝產物。CPMG實驗的譜寬為8 000 Hz，采樣點數64 k，采樣時間4 s，累加次數64次，τ為200 ms，2 nτ為320 ms，弛豫延遲為2 s，其間采用低功率脈沖對水峰進行預飽和。LEDbpp實驗的譜寬為8 000 Hz，采樣點數64 k，采樣時間4 s，累加次數64次，擴散時間為100 ms，τ為5 ms，弛豫延遲為2 s，其間采用低功率脈沖對水峰進行預飽和。在對自由感應衰減（free induction decay，FID）信號數據進行填零，分別加上1 Hz（CPMG實驗）和3 Hz（LEDbpp實驗）的線增寬因子后進行傅立葉變換轉得到1H-NMR譜圖。以乳酸甲基信號雙峰的左側峰定標為δ1.33。

1.5 NMR數據處理 對所得NMR數據經傅立葉變換得到譜圖，調整相位并進行基線校正。對CPMG數據，將0.4～4.4范圍內的譜按照每段0.04 Pulse Position Modulation（ppm，一種脈沖位置根據被調信號的變化而變化的調制方法）。進行分段積分；對LED數據，將0～6.0范圍內的譜按照每段0.04 ppm進行分段積分，并將4.6～5.0之間的譜排除。將積分按每張譜的總積分強度歸一化。所得數據輸出并轉換到Excel文件保存。

1.6 數據分析 將保存的Excel格式數據輸入到SIMCA-P+軟件（v10.04，Umetrics，Umea，Sweden）進行多元統計分析。數據采用平均中心化（mean centering）或Pareto標度化（Pare?to scaling）進行預處理之后行主成份分析（PCA）。對于因受各種因素影響而導致組內個體差異特別大的情況，采用正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC）處理后進行偏最小二乘法（PLS）分析。分析結果以得分圖（scores plot）和載荷圖（loadings plot）的形式表示。

2 結果

2.11H-NMR圖譜模式變化圖 得分圖顯示組間代謝模式具有差別，見圖1A、B；載荷圖示導致上述差別的具體代謝物為極低密度脂蛋白（VLDL，δ0.9、1.3）、乳酸（Lac，δ1.34）、乙醇（Ethanol，δ1.18、3.66）、飽和脂肪酸（SFA，δ1.58、2.22）、N-乙酰糖蛋白（Nac，δ2.06）、谷氨酰胺（Gln，δ2.42、2.46）、卵磷脂（PC，δ3.22）、葡萄糖（glucose，δ3～4），見圖1 C、D。

2.2 代謝物變化分析 核磁共振譜圖示HUA組較健康對照組的血漿代謝物中SFA、Nac、VLDL、Lac、Ethanol的水平上升，PC、glucose、Gln的水平較健康對照組下降，見圖2、3。

3 討論

1H-NMR代謝組學法是通過分析核磁共振譜圖上不同化學位移處的色譜信號，推斷相應代謝物水平的高低，從而得到體內代謝組（metabolome）即生物樣本、系統、組織或細胞中小分子化合物的總體信息的過程。

由于女性體內雌激素能夠促進尿酸排泄，不同性別的HUA患病率不同；吸煙、飲酒、膳食等不同的生活方式對代謝組學的結果均有影響。本組選取有吸煙、飲酒嗜好的男性為研究對象，研究對象早、午均在單位就餐，HUA組生活方式盡可能一致，以均衡生活方式因素對于代謝組學結果的影響。

本研究中對1H-NMR CPMG譜的主成分分析結果顯示，HUA組較健康對照組血漿中Nac、Lac、Ethanol的水平上升；PC、Gln、glucose的濃度降低，表明2組血漿代謝物的組成成分能夠明顯區分兩者。對1H-NMR LED譜的主成分分析結果示，從脂類代謝產物上區分了HUA組和健康對照組，表現為HUA組較健康對照組SFA、Nac、VLDL的水平上升；PC的水平下降。

有研究認為血漿中的SFA濃度、VLDL的水平與心血管疾病的發病危險性成正比，而PC則是心血管疾病的保護性因素，且大量流行病學證據和臨床研究均證實了HUA是心血管事件的獨立危險因素[5]。本研究結果提示HUA組與心血管疾病發生了相同的脂類代謝改變，這從分子水平反映了HUA與心血管疾病的聯系。Lac是糖酵解過程正常代謝產物，Lac水平的上升，提示糖酵解加劇，由glucose無氧酵解生成的Lac增多。2型糖尿病常有輕微的高乳酸血癥，這可能與Lac的氧化缺陷有關[6]。HUA患者血漿中乳酸水平升高，可能是因為與2型糖尿病有共同的發病機制，也可能是由于病程中具有共同的病生理改變，尚有待進一步研究確認。

綜上，HUA患者存在脂類代謝異常、糖酵解加劇等問題，這些代謝物的改變可能與HUA的發病、病程轉歸有關，也可能為HUA與MS各組分的關系研究提供線索與依據。

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[4]葉任高，陸再英.內科學[M].第6版.北京：人民衛生出版社，2006：865.

[5]胡大一，丁榮晶.無癥狀高尿酸血癥合并心血管疾病診治建議中國專家共識[J].中國全科醫學，2010，13（4B）：1145-1149.

[6]呂建新，鄭景晨.內分泌及代謝疾病的檢驗診斷[M].北京:人民衛生出版社，2007：179.