高壓氧治療對正常及SIRS大鼠脾細胞凋亡的影響

中國醫科大學附屬第一醫院急診科(110001) 葛百平 趙寶寶 馮 芳 王 鋼

作者:葛百平，中國醫科大學急診科研究生在讀，現工作單位沈陽急救中心。

導致系統性炎癥反應綜合征(SIRS)和多器官功能衰竭(MODS)發生的主要誘因幾乎能誘發所有類型細胞的凋亡[1-2]，免疫炎癥細胞凋亡紊亂及靶器官細胞大量凋亡的結果也可能是SIRS/MODS發生發展的因素之一[3-7]。SIRS的發生發展過程中有多種因素可以啟動細胞凋亡。目前的研究認為，免疫細胞的大量凋亡是SIRS狀態下免疫功能低下的重要原因。高壓氧(HBO)治療應用于SIRS狀態下的研究目前主要集中于炎癥、缺血/再灌注損傷等方面。而HBO對SIRS狀態免疫功能影響方面的研究比較少見。HBO治療指的是在2～3ATA(1ATA=101.325kPa)下給 100%的 O2，使動脈血氧分壓(PaO2)達2000mmHg(1mmHg=0.133kPa)，組織血氧分壓達400mmHg。HBO是一氧化碳中毒、減壓病和動脈氣體栓塞首選治療方法，在放射性骨病、梭狀芽孢桿菌性肌壞死、難治性骨髓炎等疾病和皮膚移植中的療效也被充分肯定[8]，目前關于其在嚴重創傷或感染導致的SIRS狀態下的應用也逐步探索。脾臟作為機體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心，在對臨床患者的研究中表明，SIRS患者存在明顯的脾臟淋巴細胞凋亡的增加[9]。本實驗就正常及SIRS狀態下的大鼠脾細胞凋亡為對象，研究HBO治療對于正常及SIRS狀態下機體的免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性SD大鼠50只，購自中國醫科大學實驗動物中心，體重約140～180g，隨機分為5組，每組10只。A組:腹腔注射等量生理鹽水;B組:腹腔注射等量生理鹽水，做3次HBO;C組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500mg/kg);D組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500mg/kg)，做1次HBO;E組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500mg/kg)，做3次HBO。

1.2 主要試劑、儀器 酵母多糖-A(Sigma公司);AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑/試劑盒(Biovison公司);流式細胞儀，DWC400A/02-1型動物HBO艙。

1.3 大鼠SIRS模型建立 將酵母多糖粉劑和無菌液體石蠟混合，高頻振蕩15分鐘，100℃水浴80分鐘滅菌，制成濃度為100mg/mL的酵母多糖A-石蠟混懸液，存放于4℃備用。臨用前40℃ 水浴復溫，高頻振蕩15分鐘后供注射。大鼠實驗前18小時開始禁食，不禁水。C、D、E組以500mg/kg體重予大鼠腹腔注射酵母多糖A-石蠟懸液，A、B組注射等量生理鹽水。

1.4 HBO治療方案 1次HBO的時間為腹腔注射后4小時，3次HBO的時間分別為腹腔注射后4小時、10小時、18小時。每次 HBO都遵循以下方案:100%純氧洗艙5分鐘，以清除艙內原有空氣。勻速加壓至2ATA(15分鐘)，用已校對的測氧儀測艙內氧濃度達90%以上，期間以4L/min的速度持續通O2避免CO2蓄積，并將壓力維持在2ATA。1小時后以同樣速度勻速減至常壓，出艙。

1.5 標本采集及檢測 腹腔注射24小時后，標記大鼠順序殺鼠取脾、標號，脾臟剪至糊狀，100目篩濾過(加PBS)，離心1000rpm10分鐘，棄上清，低滲休克法溶解紅細胞，RPMI1640調整細胞濃度1×106/mL，取上述液體0.1mL進行如下步驟:4℃離心10分鐘，棄上清，加入冷PBS1mL，輕輕震蕩，于4℃下1000rpm離心10分鐘，棄上清，重復2次，加200μL Buffer，加 10μLAnnexinV-FITC，加 PI10μL，置于25℃，15 分鐘，加300μLBuffer，30 分鐘內上機檢測，以上按照AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑/試劑盒說明書操作。

1.6 統計方法 用SPSS18.0forWindows軟件分析數據。各組數值用均數±標準差表示，采用One-WayANOVA方法，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 大鼠SIRS模型建立效果 腹腔注射酵母多糖-石蠟溶液組大鼠呼吸急促，伴有明顯喘鳴，皮膚黏膜發紺，出汗，毛色灰暗，部分大鼠有鼻出血，腹脹，腹瀉。大鼠進食明顯減少，活動差，對外界刺激無反抗。殺鼠后，見SIRS組大鼠腹腔滲出增多，腸管擴張，程度不一。肝臟呈暗紅色或暗紫色。肺臟可見不同程度腫脹，部分可見充血出血點。心臟、腎臟、脾臟、胰腺無明顯大體改變。

2.2 HBO治療的影響

2.2.1 HBO對正常脾細胞凋亡的影響 在本次實驗中，經過HBO治療的大鼠脾細胞凋亡有增加，但與正常組相比較，差異無顯著性(P＞0.05)。

2.2.2 SIRS狀態對大鼠脾細胞凋亡的影響 在本實驗中，SIRS狀態下大鼠脾細胞的凋亡率比對照組有明顯升高(P ＜0.05)。

2.2.3 HBO對 SIRS大鼠脾細胞凋亡的影響 在SIRS組中，HBO顯示了明顯的作用，無論是1次HBO組，還是3次HBO組，凋亡率均明顯減少(P＜0.05)，但此實驗中，1次 HBO組和3次HBO組并未發現有明顯差異(P＞0.05)。各組脾細胞凋亡比例分別是A組(13.30±8.94)%;B組為(16.25±11.24)%;C 組為(25.40 ±4.17)%;D 組為(12.91 ±3.67);E 組為(15.97 ±4.27)%。各組間比較，B組與A組比較，P ＞0.05;C組與A、B組比較，P＜0.05;D組、E組與C組比較，P＜0.05;D組與E組比較，P ＞0.05。

各組脾細胞凋亡比例的比較，見圖1。

圖1 各組脾細胞凋亡比例的比較

3 討論

SIRS概念是上世紀90年代提出，經10余年的研究探索，發現從感染、創傷等病因發展到MODS的過程中，都存在著一條共同通路，即SIRS。SIRS具有以下特征:1)體溫＞38℃或＜36℃。2)心率＞90次/分。3)呼吸 ＞20次/分或 PaCO2＜32.33mmHg。4)血白細胞 ＞12×109/L或＜4 109/L，或未成熟粒細胞＞103。具備上述表現2種或以上可確認為SIRS，上述標準后于2001年增加了炎癥指標及高排低阻的血液動力學指標，白細胞介素-6(IL-6)達 279 ～ 5979pg/L 被 認為 存 在 SIRS[10]。Bone將典型的SIRS分成5個時期:第1期為局部炎癥反應期，炎癥反應局限于感染或損傷局部;第2期為全身炎癥反應始動期，早期的促炎及隨后的抗炎介質進入體循環;第3期為全身炎癥反應期，機體出現失去控制的，自我持續放大和自我破壞的炎癥，表現為播散性炎細胞活化、炎癥介質泛濫形成瀑布效應，并由此引起遠隔部位的炎癥反應，引起組織損傷。第4期為代償性抗炎反應綜合征(CARS)期，抗炎反應過度，導致免疫功能抑制及對感染的控制和抵抗能力下降;第5期為免疫不協調期，表現為多臟器功能失調，病死率高，即MODS[11-12]。失控的炎癥反應導致的免疫功能失調是SIRS狀態的特點。

細胞凋亡又被稱為程序性細胞死亡(PCD)，是一種重要的生命現象，不僅出現在生理情況下，更與腫瘤、自身免疫性疾病及退行性神經病變等多種疾病密切相關。在近年來的研究中，細胞凋亡在SIRS到MODS的發生發展的過程中備受關注[13]。

SIRS狀態下，機體處于強烈應激狀態，全身血流重新分布，胃腸、肝膽系統、腎臟甚至肺臟血管強烈收縮，內臟缺血缺氧。持續的缺氧，長時間的高濃度兒茶酚胺刺激，內源性阿片肰對腎上腺能受體(AR)的抑制等原因，使全身的AR敏感性降低甚至失敏，此時內臟血管重新開放，造成內臟組織的缺血再灌注損傷(IR)，自由基、炎癥介質及細胞因子并大量釋放，內臟瘀血缺氧，微循環障礙，細胞能量代謝障礙[14]。眾所周知，這些因素都可以導致免疫細胞和實質細胞凋亡，免疫細胞大量凋亡的結果會導致免疫功能低下[7，15]，實質細胞的凋亡則產生器官功能障礙[16]。

有研究證實，線粒體是缺血、缺氧損害的核心靶細胞器，線粒體損害是全身性缺血、缺氧損害的最關鍵環節。近年來的研究表明，細胞凋亡過程中，線粒體起到了至關重要的作用。線粒體是細胞生命活動控制中心，它不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細胞凋亡調控中心，與凋亡相關的很多關鍵事件都發生于線粒體，在凋亡的線粒體途徑中，線粒體上的線粒體通透性轉變孔道(PT孔道)被認為是細胞的生死開關，PT孔開放會引起線粒體跨膜電位ΔΨm下降和細胞色素C釋放，一旦線粒體跨膜電位因能量代謝障礙而耗散，細胞將進入不可逆的凋亡[17-18]。

HBO對機體SIRS狀態的治療作用是系統而不是局部的增加氧張力，提高氧分壓，可以改變血流攜氧方式，以物理溶解的方式向缺血組織供氧，增加氧的彌散距離，甚至能夠到達因微循環阻塞而紅細胞不能到達的組織，從而改善微循環，改善缺血、缺氧組織血供，甚至可以使組織達到無血存活。研究顯示，HBO治療可以減少致炎介質的數量，有明顯的抗炎作用。HBO治療酵母多糖誘導休克的大鼠實驗研究證實，HBO治療減少SIRS狀態下TNF-alpha分泌[19]。創傷失血性休克復蘇后大鼠腸道組織TNF-alpha水平明顯升高，HBO治療顯著降低TNF-alpha水平，抑制過度炎癥反應[20]。Kaelin等在鼠游離皮瓣移植應用HBO處理的研究中發現，SOD活性明顯升高，從而減少氧自由基。HBO治療能夠改善缺血、缺氧組織的供氧，阻斷細胞能量代謝障礙，穩定線粒體跨膜電位 ΔΨm[21]。

本實驗結果顯示，SIRS狀態下脾細胞凋亡明顯增加(P ＜0.05)，而HBO治療顯著降低了SIRS狀態下大鼠脾細胞凋亡(P＜0.05)。HBO治療1次與3次組并未有明顯差異(P ＞0.05)，這說明HBO治療能減少SIRS狀態下的脾細胞凋亡，且這種作用不依賴于暴露的劑量和時間。HBO治療減少脾細胞凋亡可能的機制，首先是HBO治療能改善機體缺血缺氧，改善微循環，保證能量代謝，維持 ATP水平，阻止線粒體損傷，防止細胞凋亡;其次HBO治療有抑制過度的炎癥反應作用，減少TNF-alpha等炎癥介質，從而抑制脾細胞凋亡;再次，HBO治療可能通過減少自由基的產生，抑制生物膜的脂質過氧化，從而阻斷細胞的凋亡過程。

研究結果[23-25]，給予HBO治療，可以導致自由基產生，隨后SOD活性反應性的升高，結果導致總體上自由基減少，但隨著治療劑量的增加，SOD的耗盡，自由基產生會再次增加。因此，HBO治療應用于臨床，其治療時機、劑量，以及治療中抗氧化劑的應用等都需要進一步研究。目前關于HBO治療能否阻斷SIRS狀態發展到MODS的研究已經有所開展，本實驗表明HBO治療在這方面有廣闊的前景。

[22]

[1] 許永華，楊興易.危重病的細胞凋亡發生機制及其治療前景[J].急救醫學雜志，2003，23(6):407

[2] 許國根，王弋，繆群，等.全身炎癥反應綜合征患者抗炎因子對T淋巴細胞凋亡的影響[J].中華急診醫學雜志，2002，11(4):249

[3] Cantaluppi V，Assenzio B，Pasero D，et al.Polymyxin-B hemoperfusion inactivates circulating proapoptotic factors[J].Intensive Care Med，2008，34(9):1638

[4] Mariano F，Cantaluppi V，Stella M，et al.Circulating plasma factors induce tubular and glomerular alterations in septic burns patients[J].Crit Care，2008，12(2):42

[5] Kucklebrug CJ，Tiwari R，Czuprynski CJ.Endothelial cell apoptosis induced by bacteria-activated platelets requires caspase-8 and-9 and generation of reactive oxygen species[J].Thromb Haemost，2008，99(2):363

[6] Gambim MH，Carmo Ade O，Marti L，et al.Platelet-derived exosomes induce endothelial cell apoptosis through peroxynitrite generation:experimental evidence for a novel mechanism of septic vascular dysfunction[J].Crit Care，2007，11(5):107

[7] Hotchkis RS，Chang KC，Gmyson MH，et al.Adoptive transfer of apoptotic splenocytes worsens survival，whereas adoptive transfer of necrotic splenoeytes improves survival in sepsis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(11):6724

[8] Al-Waili NS，Butler GJ，Petrillo RL，et al.Hyperbaric oxygen and lymphoid system function:A review supporting possible intervention in tissue transplantation[J].Technol Health Care，2006，14(6):489

[9] Hotchkiss RS，Tinsley KW，Swanson PE，et al.Sepsis-induced apoptosis causes progressive profound depletion of B and CD4+T lymphocytes in humans[J].J Immunol，2001，166(11):6952

[10] Levy MM，Fink MP，Marshall JC，et al.2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS international sepsis definitions conference[J].Crit Care Med，2003，31(4):1250

[11] Martignoni A，Tschep J，Goetzman HS，et al.CD4-expressing cells are early mediators of the innate immune system during sepsis[J].Shock，2008，29(5):591

[12] 黃志英.感染性休克研究進展[J].中國衛生檢驗雜志，2009，19(3):709

[13] Hotchkiss RS，Swanson PE.Apoptotic cell death in patients with sepsis，shock and multiple organ dysfunction[J].Crit Care Med，1999，27(7):1230

[14] 龍曉弘，趙曉琴.多器官功能障礙綜合征發病機制研究進展[J].蛇志，2007，19(2):145

[15] Wesche DE，Lomas-Neira JL，Perl M，et al.Leukocyte apoptosis and its significance in sepsis and shock[J].J Leukoc Biol，2005，78(2):325

[16] Hori Y，Takeyama Y，Ueda T，et al.Macrophage-derived transforming growth factor-beta1 induces hepatocellular injury via apoptosis in rat severe acute pancreatitis[J].Surgery，2000，127(6):641

[17] 梁晚益，黃躍生，楊宗城.嚴重燒傷早期心肌線粒體磷脂變化及其機制[J].中華創傷雜志，2001，17(7):416

[18] 謝燕，朱光旭，江海洪，等.缺氧-復氧對心肌細胞NRF1與mt2TFR表達的影響[J].第三軍醫大學學報，2001，23(12):1399

[19] Yamada T，Taguchi T，Hirata Y，et al.The protective effect of hyperbaric oxygenation on the small intestine in ischemia-reperfusion injury[J].J Pediatr Surg，1995，30(6):786

[20] 金立方，王為成，王鋼.HBO防止創傷/失血性休克復蘇后大鼠腸道缺血-再灌注損傷[J].中華急診醫學雜志，2009，18(11):1183

[21] Kaelin CM，Im MJ，Myers Ra，et al.The effects of hyperbaric oxygen on free flaps in rats[J].Arch Surg，1990，125(5):607

[22] Kudchodkar B，Jones H，Simecka J，et al.Hyperbaric oxygen treatment attenuates the pro-inflammatory and immune responses in apolipoprotein E knockout mice[J].Clin Immunol，2008，128(3):435

[23] Buras JA，Holt D，Orlow D，et al.Hyperbaric oxygen protects from sepsis mortality via an IL-10-dependent mechanism[J].Crit Care Med，2006，34(10):2624

[24] Chen MF，Chen HM，Ueng SWN，et al.Hyperbaric oxygen pretreatment attenuates hepatic reperfusion injury[J].Liver，1998，18(2):110

[25] G Thom S.Functional inhibition of leukocyte b2 integrins by hyperbaric oxygen in carbon monoxide-mediated brain injury in rats[J].Toxicol Appl Pharmacol，1993，123(2):248