基于生長時間光譜法的大腸菌群單管定量檢測技術(shù)研究

蔡盡忠，莊峙廈,2，趙麗，湯新華，鄢慶枇

（1.廈門華廈職業(yè)學(xué)院食品藥品安全檢測實驗室，福建廈門 361024）

（2.廈門大學(xué)化工學(xué)院，福建廈門 361005）

（3.廈門斯坦道生物公司，福建廈門 361006）

（4.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門 361021）

大腸菌群（Coliforms）分布較廣，在溫血動物糞便和自然界中廣泛存在，故與大腸埃氏菌（Escherichia coli）一起被國際公認為檢測醫(yī)藥、食品及各種水質(zhì)在流行病學(xué)上安全性的指示菌[1,2]。大腸菌群傳統(tǒng)檢測方法耗時長、靈敏度低、特異性差，不能適應(yīng)快速檢測的需要。因此建立以特定底物為基礎(chǔ)的新檢測技術(shù)越來越受到重視[3]。目前以特定底物為基礎(chǔ)的新檢測技術(shù)仍然是基于MPN的方法而建立的[4,5]，雖然檢測時間優(yōu)于傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法，但仍需18-24h甚至更長時間才能判定結(jié)果，而且操作繁瑣。本文以O(shè)NPG為底物，研究初始接菌濃度與達到特定吸光度所需時間的關(guān)系。因分光光度計測得的吸光度值在0.2～0.8范圍較為準確，為了達到快速檢測的目的，故選擇吸光度值下限0.2為特定的吸光度值。力求在更短時間內(nèi)檢測出大腸菌群并通過達到0.2吸光度所需時間來確定大腸菌群濃度。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

大腸菌群混合菌株HX16.3分離于生活污水并鑒定（包括大腸埃希桿菌屬、腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯菌屬）。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

ONPG購買自美國Sigma公司

ONPG培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g，ONPG 500mg，硫酸鋅0.5mg，硫酸鎂0.1g，氯化鈣100mg，磷酸二氫鉀0.9g，磷酸氫二鉀7.6g，氯化鈉10g，蒸餾水定容至1000mL，pH7.2。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基：按《微生物學(xué)實驗》[6]配制。

1.3 儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（PHX-280）

大腸菌群快速檢測儀（STD-CF）

1.4 菌懸液制備

將大腸菌群混合菌株HX16.3接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上培養(yǎng)18h后，用0.9%生理鹽水洗脫制成菌懸液，然后調(diào)整到適當濃度待用。

1.5 ONPG酶解產(chǎn)物最佳檢測波長的確定

將接種大腸菌群HX16.3并培養(yǎng)10h的ONPG培養(yǎng)液，大腸菌群HX16.3菌懸液，未接種大腸菌群的ONPG培養(yǎng)液進行全波長（200～800nm）掃描。

1.6 大腸菌群初始接種濃度與達到0.2吸光度所需時間的關(guān)系

將不同稀釋度10-3，10-4，10-5，10-6，10-7大腸菌群混合菌株HX16.3接種1mL至裝有10mLONPG培養(yǎng)基的瓶子中，并放到大腸菌群快速檢測儀，將吸收波長設(shè)定于410nm，每10秒測定一次吸光度值，于37℃培養(yǎng)17小時。同時10-5，10-6，10-7稀釋度的菌液用平板計數(shù)法[6]確定菌濃度。

1.7 單管定量法與多管發(fā)酵法的相對標準偏差

將1ml大腸菌群懸液接種到至裝有10mLONPG培養(yǎng)基的瓶子中，分別接種8管，并放到大腸菌群快速檢測儀，將吸收波長設(shè)定于410nm，每10秒測定一次吸光度值，于37℃培養(yǎng)17小時。然后根據(jù)1.6得到的初始接種濃度與達到0.2吸光度所需時間的關(guān)系求出菌濃度，計算單管定量法的相對標準偏差，并與多管發(fā)酵法測定結(jié)果的相對標準偏差進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 ONPG酶解產(chǎn)物最佳檢測波長的分析

對影響ONPG酶解產(chǎn)物最佳檢測波長的各因素進行全波長掃描，結(jié)果如圖2-1所示。接種大腸菌群HX16.3并培養(yǎng)10h的ONPG培養(yǎng)液有兩個相對最大吸收波長，即309和410nm，大腸菌群HX16.3菌懸液有兩個相對最大吸收波長，即305和396nm，未接種大腸菌群的ONPG培養(yǎng)液兩個相對最大吸收波長，即307和330nm。為使底物和菌體的吸光度對結(jié)果的影響最小， 故ONPG酶解產(chǎn)物最佳檢測波長確定為410nm。

2.2 大腸菌群初始接種濃度與達到0.2吸光度所需時間的關(guān)系

平板計數(shù)法得出10-6稀釋度的菌濃為197cfu/mL，10-7稀釋度的菌濃為20cfu/mL。各稀釋度菌液生長時間光譜圖如圖2-2所示。各稀釋度菌液初始接種濃度常用對數(shù)值與達到0.2吸光度所需時間的關(guān)系如圖2-3所示。結(jié)果表明當初始菌濃度范圍在101.3～105.3cfu/mL時，初始菌濃度常用對數(shù)值與達到0.2吸光度所需時間具有良好的線性關(guān)系，計算公式為y = -0.0138x + 8.759。

2.3 單管定量法與多管發(fā)酵法的相對標準偏差

生長時間光譜法測定8個平行樣的譜圖如圖2-4所示，相對標準偏差為11.5%，多管發(fā)酵法相對標準偏差為53.3%。由此可見基于生長時間光譜法的單管定量檢測的相對標準偏差遠遠低于多管發(fā)酵法。

圖2-2 各稀釋度菌液生長時間光譜圖

圖2-3 初始菌濃度常用對數(shù)值與達到0.2吸光度所需時間的關(guān)系

圖2-48個平行樣生長時間光譜圖

3 討論

國內(nèi)外有關(guān)樣品中大腸菌群濃度的測定，不管是多管發(fā)酵法還是酶底物法主要是通過MPN來確定，雖然優(yōu)于傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法，但仍需要培養(yǎng)18-24h甚至更長時間才能判定結(jié)果，不能滿足快速檢測的需要。

本文以O(shè)NPG為底物，研究大腸菌群混合菌株HX16.3初始接種量與達到0.2吸光度所需時間的關(guān)系，擬合的線性關(guān)系的菌濃度范圍為101.3～105.3cfu/mL，發(fā)現(xiàn)它們存在良好的線性關(guān)系（R2=0.9976），反應(yīng)所需的時間短，當初始菌濃為101.3cfu/mL時反應(yīng)時間僅需9h，且其標準偏差低于多管發(fā)酵法，可以作為大腸菌群快速檢測的方法，具有良好的應(yīng)用前景。

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[6]沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實驗（第三版）［M］.北京：高等教育出版社，1999.