人CD9基因的克隆及原核蛋白表達

鄭小莉，羅 波，張 藝，劉佳佳

(瀘州醫學院 a.基礎醫學院生物化學教研室;b.基礎醫學院機能實驗室;c.基礎醫學院免疫學教研室，四川 瀘州 646000)

人CD9基因編碼的CD9蛋白屬于“4次跨膜蛋白”(Tetraspanin)超家族成員，該蛋白分子含有4個疏水區，往返4次穿過細胞膜［1］。CD9蛋白在人體組織細胞中分布較為廣泛，主要分布在血小板、前B細胞、單核細胞等造血細胞，以及骨髓細胞、腦細胞和肌肉細胞中，另外CD9還普遍在不同組織的干細胞表面表達，在卵母細胞中也有表達。CD9蛋白的功能也較為復雜，主要介導與細胞支持、細胞黏附、細胞運動、細胞增殖、細胞融合及腫瘤細胞的轉移相關的細胞信號轉導，同時CD9蛋白還是精卵質膜相互作用中一種重要的蛋白［2－3］。近年來，CD9功能的研究已成為一個熱點，因為在諸多臨床研究中發現CD9的表達與腫瘤的發生和轉移具有重要相關性。本實驗擬通過克隆CD9基因的全長開放閱讀框，并進行原核蛋白表達，為對CD9的進一步研究創造條件。

1 材料與方法

1.1 材料

人外周靜脈血，均從健康自愿者抽取。Trizol購自Invitrogen公司;Dextran T－500購自Gibco公司;RT-PCR試劑盒購自Takara公司;引物由上海生工合成;Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶(XhoI，BamHI)、pMD 18T 載體、PET30a(+)載體、Trizol試劑購自Takara公司;膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒購自天根公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 外周血細胞的獲得

抽取健康志愿者外周靜脈血50 mL，2%EDTA抗凝，立即混勻。室溫下300 g/min×20 min離心。去掉上層血漿，用等量的1×PBS替代去掉的血漿，用0.6%的 dextran T500沉淀紅細胞。30～45 min后，將清液小心的轉移到一個新管中，然后離心170 g/min×5 min，去掉上清。

1.2.2 總 RNA 提取

收集上一步中獲得的細胞，PBS洗滌后轉移至1.5 mL微量離心管中，1 000 g離心10 min，棄上清，加入1 mL Trizol試劑，立即反復抽吸至細胞充分裂解，靜置5 min，加入200 μL氯仿劇烈振蕩15 s，低溫離心機4℃、12 000 g離心20 min。取水相至一新的微量離心管中，加入等體積的異丙醇，4℃靜置60 min，低溫離心機4℃、12 000 g離心20 min，棄上清，750 mL/L乙醇洗滌沉淀2次。4℃ 、5 000 g離心10 min，棄上清，沉淀自然干燥3 min，加入15 μL 無 Rnase水溶解沉淀。取5 μL進行凝膠電泳;2 μL用于反轉錄。

1.2.3 反轉錄合成和PCR擴增

反轉錄反應采用M-MLV反轉錄試劑盒，反轉錄反應條件為:30℃、10 min，42℃、1 h，95℃、5 min，5℃、5 min。為了后續原核表達蛋白及純化更加容易，以M-MLV反轉錄酶合成的cDNA第1鏈為模板，用分別引入了Kpn和Xho酶切位點及保護堿基的特異引物對(CD9－F:CGGTCAAAGGAGGCACC;CD9－R:CTAGACCATCTCGCGGTTCCT)進行PCR。產物進行凝膠電泳，目的片段切膠按膠回收試劑盒說明進行。

1.2.4 目的片段與T載體連接

連接體系參照T載體試劑盒說明書，16℃連接過夜。將全量連接產物轉化至感受態細菌100 μL中;在含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養基上37℃培養12 h，形成單菌落。PCR檢測確定陽性克隆后，挑取少許搖菌，37℃，200 r/min振搖擴增過夜后，提取質粒交深圳華大基因公司測序鑒定。

1.2.5 重組表達載體的構建及重組蛋白在大腸桿菌中的融合表達

將測序正確的連接有目的片段的重組T載體及PET30a(+)分別進行Kpn和Xho雙酶切，產物行凝膠電泳，切取目的片段及線性質粒膠回收純化。膠回收后酶切CD9片段與酶切質粒以1∶10的質量比，加入T4連接酶，16℃連接過夜。連接產物電轉化大腸桿菌感受態JM109菌株，挑取經轉化子，由上海Sangon測序。質粒小量抽提試劑盒提取測序正確的PET30a(+)/CD9重組質粒，電轉化大腸桿菌感受態BL21(DE3)菌株。挑取經PCR驗證的轉化子單菌落，接種至20 mL含70 mg/L Kan LB液體培養基的50 mL三角瓶中，37℃、250 rpm 搖至OD600為0.6，加IPTG至終濃度為1 mM，30℃、160 rpm誘導表達。于誘導表達0、1、2、3、4、5、6 h 取菌體 1 mL，離心得菌體;加入SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸3 min;10 000 g離心10 min;取上清，15%SDS-PAGE分析，同時取空質粒轉化子誘導6 h的產物作為對照。

1.2.6 融合蛋白的純化

挑取轉化子單菌落，接種至20 mL含70 mg/L Kan LB液體培養基的50 mL三角瓶中，37℃、250 rpm培養過夜;取1mL菌液接種至200 mL含70 mg/L Kan LB液體培養基的500 mL三角瓶中，37 ℃、250 rpm 培養至 OD600 為 0.6 ～0.8，加入IPTG至終濃度為1 mm，誘導表達5 h;10 000 g 10 min離心得菌體，菌體用20 mL裂解液(50 mm Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，100 mm NaCl，1 mm PMSF，10 mg/L溶菌酶)重懸，反復凍融直至菌液清亮透明，14 000 g，15 min，離心得沉淀;分別用1 M、2 M、4 M(50 mM Tris-HCl，0.9%NaCl，pH8.0)的尿素緩沖液溶液，14 000 g，15 min，洗滌沉淀;加入裂解結合緩沖液(8M尿素，50mM Tris-HCl，0.1M Na2HPO4，pH 8.0)10 mL，4 ℃ 溶解過夜，16 000 g，30 min，取上清。將0.8 mL鎳親和層析樹脂加入至親和層析柱中，3倍樹脂體積的超純水洗柱3次，3倍樹脂體積的裂解結合緩沖液平衡樹脂，上柱3mL包涵體溶液，再分別用3倍樹脂體積的裂解結合緩沖液、洗滌緩沖液(8M尿素，50mM Tris-HCl，0.1M Na2HPO4，pH 6.3)洗柱 3次;最后用1.0 mL的洗脫緩沖液(8M尿素，50mM Tris-HCl，0.1M Na2HPO4，pH 4.5)洗柱 2 次，用1.5 mL EP管分別分裝兩次洗脫的產物。

2 結果

2.1 CD9基因開放閱讀框的克隆

CD9基因開放閱讀框的長度為690bp。由于在設計特異引物時，特意在上下游引物的兩端分別引入了Kpn和Xho酶切位點及保護堿基，因此，擴增出的CD9基因片段的長度為709bp。PCR擴增結束后凝膠電泳顯示，在709bp處有明亮特異條帶，與預期結果一致(圖1(a))。將擴增得到的含Kpn和Xho酶切位點的CD9基因片段與pMD18T載體連接，隨即挑取轉化子進行PCR檢測，結果顯示在709bp處出現了特異條帶(圖1(b))。經測序分析顯示，克隆的基因片段與NCBI中CD9基因的開放閱讀框全長相似形為100%(圖2)。該結果與預期相符，說明CD9基因的開放閱讀框已經被成功克隆。

圖1 CD9克隆結果

圖2 CD9測序結果與NCBI CD9基因序列比對結果

2.2 原核表達及產物純化

成功克隆了CD9的開放閱讀框后，將CD9基因與PET30a(+)原核表達載體融合構建表達載體，并隨機挑取數個BL21(DE3)轉化子，經PCR驗證其在690bp左右出現特異條帶(圖3)。

圖3 CD9轉化子PCR檢測結果

將經PCR驗證的轉化子進行誘導表達，利用鎳親和層析，得到融合蛋白，經考馬斯亮藍染色顯示在 30KDa處出現單一條帶(圖 4)。由于PET30a(+)表達融合蛋白，融合片段的大小約為5KDa，而CD9蛋白分子量大約為25KDa，30KDa的融合蛋白與預期相符。表明本研究利用鎳親和層析柱，成功表達并純化到了較高純度的PET30a(+)/CD9融合蛋白。

圖4 純化后的PET30a(+)/CD9融合蛋白考馬斯亮藍染色結果

3 討論

CD9蛋白在人體組織細胞中分布較為廣泛，目前對于CD9的研究主要集中在CD9的表達與腫瘤發生的相關性方面。臨床研究表明CD9可能是一種抑癌基因，例如:CD9在正常膀胱組織中的表達較高，而在膀胱癌組織中CD9則發現其表達降低［4］。臨床研究表明CD9也可能是一種腫瘤轉移抑制因子，因為CD9蛋白和CD9基因水平在原發腫瘤的表達均比轉移性腫瘤有明顯增高［5］。另外，CD9的表達情況對于白血病患者的分型、療效、預后有較緊密的關系，淋系白血病(特別是TALL、B-ALL及CLL)和髓系白血病(特別是 M3、M5及CML)中CD9表達均較對照組高［6］。綜上所述，CD9的表達對于諸多腫瘤的發生和轉移機制研究均具有重要意義，因此，利用相應的抗體檢測CD9蛋白的表達具有十分重要的研究價值，但是目前市售的CD9多克隆抗體仍然較少。

本研究利用大腸桿菌成功地融合表達了CD9蛋白。該融合蛋白可用于下游多克隆抗體的制備，這為后續實驗進一步研究探討CD9的功能奠定了基礎。

［1］Higashihara M，Takahata K，Yatomi Y，et al.Purification a n d partial characterization of CD9 antigen of human platelets［J］.FEBS Lett，1990，264:270 －274.

［2］Ikeyama S，Koyama M，Yamaoko M，et al.Suppression of cell motility a n d metastasis by transfection with human motility-related protein(MRP-1/CD9)DNA［J］.J Exp Med，1993，177:1231 －1237.

［3］Rubinstein E，Benoit P，Billard M，et al.Organization of the human CD9 gene［J］.Genomics，1993，16:132 －138.

［4］楊曉春，白進良，傅梧，等.MRP-1/CD9和HSP60在膀胱癌中的表達［J］.中國腫瘤臨床，2005(9):524－526.

［5］張培彤，林炳奎.腫瘤細胞表面血小板免疫相關抗原的表達及其意義［J］.中國腫瘤臨床與康復，2001，8(5):119－122.

［6］袁淑云，霍金平，蔡宗友.CD9及P170在白血病診治中的表達及其臨床意義［J］.現代醫院，2005，5(6):4－6.