子宮內膜癌細胞中RNA干擾Bmi-1基因的實驗研究及意義

林小滿 謝 娜 徐 楊

徐州醫學院附屬醫院婦產科，江蘇徐州 221002

Bmi-1（B-cell-specific moloney murin leukemia virus insertion site 1）基因早期發現在造血及神經系統的發育過程中起重要作用，它維持干細胞的自我更新能力。近年來發現Bmi-1與腫瘤的發生關系密切，在多種腫瘤中高表達。siRNA干擾技術是目前研究癌基因作用的常用方法，為研究Bmi-1基因在子宮內膜癌發生發展中的作用，本實驗在Ishikawa子宮內膜癌細胞中，運用siRNA干擾技術，檢測其干擾沉默Bmi-1基因的效果，為下一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

Ishikawa細胞株（上海復祥生物科技有限公司），DMEM/F12、Opti-MEM（GIBCO公司），胰蛋白酶（南京博爾迪生物科技有限公司），RT-PCR試劑盒（Promega公司），Lipofectamine2000（Invitrogen公司），Matrigel基質膠（BD公司），RT-PCR引物（上海生工生物技術有限公司合成）。Bmi-1引物序列上游為5’-TACAGAGTTCGACCTACTT-3’，下游為 5’-TGATGACCCATTTACTGA-3’，堿基對為291 bp，β-actin上游引物序列為：5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’，下游引物序列：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’，堿基對564 bp；siRNA由上海吉瑪公司設計，干擾靶序列為5’-GGTCCACTTCCATTGAAATAC-3’，質粒載體PGPU6/GFP/Neo-Bmi-1-654以及陰性對照空載體購（上海吉瑪公司），全波長多功能酶標儀1500于（美國Thermo fisher公司），PCR 擴增儀 533254964（德國 eppendorf公司），分光光度計（BioPhotometer plus, Eppendorf公司），凝膠成像儀2500（Tanon公司）。

1.2 Ishikawa細胞培養

將Ishikawa 細胞株按3×105/mL的密度接種于50 mL培養瓶中，培養體系為3 mL含10%FCS的DMEM培養液，放置于37℃，5%CO2孵箱中培養，每48小時換液1次，將生長良好的細胞按1×105/mL的密度接種于6孔培養板中備轉染用。

1.3 siRNA轉染

24 h后觀察6孔板內細胞密度達到60%，細胞狀態良好，即可轉染。取4個1.5 mLEP管，分為AB兩組，每組2個（1號、2號）。全部EP管均加入0.25 mL opti-MEM培養基，向A組EP管中分別加入6 μL Lipofectamine2000，向B組1號EP管加入2.5 μg siRNA質粒載體PGPU6/GFP/Neo，向B組2號EP管加入2.5μg空載體作為對照，均與培養基混勻。5 min后將A組內的液體對應加入B組中，輕輕混合。B組1號EP管即為干擾組，2號EP管即為對照組，室溫孵育20 min。取出六孔培養板，棄去培養液，PBS洗2次，將2個EP管中的轉染液對應加入2個孔中，搖晃混勻，每孔再補加1.5 mL opti-MEM培養基，做好標記，入培養箱繼續孵育，5 h后更換完全培養基。24 h后，顯微鏡下觀察細胞熒光，鏡下見約70%的細胞表達熒光蛋白，說明轉染效率較高，即可用于PCR檢測。

1.4 RT-PCR法檢測Bmi-1干擾后mRNA的表達

按照Trizol說明書分別提取Ishikawa細胞RNA干擾組（轉染48 h后）、陰性對照組的Bmi-1 mRNA。試劑劑量如下：無 核 酶 水 31μL、AMV 5×Buffer10μL、dNTPS 1μL、MgSO42μL、AMV反轉錄酶1μL、TflDNA聚合酶1μL、上下游引物各1μL、提取RNA 1μL。反應體系如下45℃45min、95℃預變性5 min后，以94℃變性30 s、57℃退火1 min和72℃延伸30s為1個循環，共30個循環。最后72℃延伸10 min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳分析。以上步驟重復3次。

1.5 統計學處理

采用SPSS17.0統計軟件，RT-PCR法檢測Bmi-1干擾后mRNA的電泳條帶灰度比值以（± s）表示，組間比較采用 t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

RT-PCR法檢測Bmi-1干擾后mRNA的表達結果，Ishikawa細 胞 RNA干 擾 組Bmi-1mRNA條 帶（泳 道1）灰度比為（0.115±0.011），陰性對照組（泳道2）條帶灰度比為（0.287±0.014），經t檢驗，P ＜0.05，差異有統計學意義，提示RNA干擾Bmi-1后，其在Ishikawa細胞中的表達降低了。凝膠電泳條帶見圖1。

圖1 Ishikawa細胞RNA干擾組、陰性對照組Bmi-1 mRNA的表達

3 討論

Bmi-1現認為是癌基因，在人類它位于10p13，cDNA全長3 203 bp，含有10個外顯子和10個內含子，其開放閱讀框編碼的蛋白含有326個氨基酸，相對分子質量為44 000～46 000，該基因廣泛表達于多種組織中。Bmi-1屬于轉錄抑制因子polycomb家族，可結合于基因組中的polycomb反應元件，使特定靶基因轉錄沉默。Bmi-1的下游靶基因是Ink4a位點，其可負性調控p16和p19的表達，進而調節細胞的增殖和衰老。目前認為，Bmi-1在造血干細胞及神經干細胞中高度表達，它維持干細胞的自我更新能力，在其發育過程中起重要作用[1-2]。Bmi-1與腫瘤的發生也關系密切，在淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌等腫瘤中均發現Bmi-1表達增強，并與腫瘤的惡性程度、侵襲及預后有關[3-8]。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。近幾年來RNAi研究取得了突破性進展，由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術被廣泛用于探索基因功能和惡性腫瘤的基因治療領域。外源性dsRNA通過耗能過程降解成21～23 nt的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）可以引發RNAi。siRNA表達載體快速、經濟、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達，所以現在已經成為探索基因功能的重要研究手段。

本實驗為研究bmi-1基因在子宮內膜癌發生發展中的作用，首先在Ishikawa細胞中進行了siRNA干擾實驗，干擾靶序列為5’-GGTCCACTTCCATTGAAATAC-3’和質粒載體PGPU6/GFP/Neo-Bmi-1-654由上海吉瑪公司設計和構建。質粒載體轉染后RT-PCR法檢測Bmi-1干擾后mRNA的表達，Ishikawa細胞RNA干擾組Bmi-1mRNA條帶灰度比經t檢驗分析，差異有統計學意義（P＜0.05），提示siRNA干擾Bmi-1后，其在Ishikawa細胞中的表達降低了。本實驗驗證了siRNA干擾沉默Bmi-1基因技術在Ishikawa細胞中的有效性，為下一步研究奠定了基礎。

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