廣東車八嶺自然保護區疑似黑熊爪鞘的分子鑒定

廖麗晶 金 崑

(中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所，北京，100091)

胡慧建 張于光 張 亮

(華南瀕危動物研究所)(中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所)(華南瀕危動物研究所)

亞洲黑熊(Ursus thibetanus)也稱黑熊，隸屬食肉目熊科(Ursidae)，生活在潮濕的叢林地區，是亞熱帶常綠闊葉林的典型物種，主要分布于俄羅斯與亞洲的印度、尼泊爾、日本、朝鮮、阿富汗和中國。目前亞洲黑熊已經被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄Ⅱ，為《中國瀕危動物紅皮書》易危種，是我國二級重點保護動物。在我國分布有5個地理亞種，即指名亞種(西藏黑熊)(S.t.thibetanus)、長毛亞種(喜峰黑熊)(S.t.laniger)、四川亞種(S.t.mupinensis)、臺灣亞種(S.t.formosanus)和東北亞種(S.t.ussuricus)［1－2］。根據各地縣志所記，上個世紀50年代以前，亞洲黑熊在廣東分布很廣泛，從粵北山區到南海之濱，從粵東到粵西都有黑熊的分布［3］。廣東車八嶺國家級自然保護區位于廣東省北部始興縣境內，地理位置為東經 114°07'39″～ 114°16'46″，北緯 24°40'29″～24°46'21″，東面與江西省全南縣接壤，是南嶺南緣保存較完整、面積較大、分布較集中、原生性較強的具有代表性的中亞熱帶常綠闊葉林。1926年始興縣縣志中有黑熊的記載，說明車八嶺地區當時還有黑熊分布。但是1992—1994年進行的廣東黑熊資源專項調查以及后來的野生動物資源調查中，發現廣東黑熊僅分布于粵北山地林區的乳源、陽山、連縣、曲江、英德、樂昌6個縣市的范圍內［3］。本研究通過分子鑒定確定車八嶺保護區發現的爪鞘來自亞洲黑熊，為近20 a來首次在該地區發現亞洲黑熊存在的痕跡，表明該地區森林生態環境不斷改善，亞洲黑熊的種群正在恢復。

1 材料與方法

材料 爪鞘來自于車八嶺國家級自然保護區內的仙人洞村附近山脊，是2010年4月23日華南瀕危動物研究所在開展國家林業局調查試點項目時所發現。因難以把握爪鞘特征，且在傳統的外形對比情況下，無法確定其物種，故采用分子鑒定方法進行鑒別。

試劑 DNA IQTM系統試劑盒、蛋白酶K和DTT來自Promega公司;QIAquick凝膠回收試劑盒來自Qiagen公司;Taq DNA聚合酶、dNTP來自天根公司;常規試劑為國產分析純。

爪鞘DNA提取 內壁刮取適量爪鞘(5.0 mg)置2.0 mL離心管，加入1.5 mL 10%SDS浸泡30 min，去離子，水沖洗3～5次，確保表面粘附的細胞完全去除。然后加入200 μL DNA IQTM系統裂解液、20 μL 10 g/L 蛋白酶 K、20 μL 1 mol/L DTT，56℃水浴9 h，待裂解完全，95℃滅活10 min。套管離心后取上清液，按DNA IQTM系統試劑盒操作手冊提取模板DNA，并溶解于50 μL洗脫液中。

PCR擴增和測序 選擇食肉目線粒體Cyt b基因的特異性引物進行物種鑒定，引物對為CAT－CytB－F:5'－AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATTTGTCCTCA－3'和CAT－CytB－R:5'－TATTCTTTATCTGCCTATACATRCACG － 3'［4］。該引物目的片段大小為105～108 bp。PCR反應體積為30 μL，體系中含有0.5 mmol/L 的 dNTPs、1.5 × PCR buffer、0.5 U 的 Taq 酶、1 μg的BSA、0.72 mmol/L的引物和2 μL模板 DNA。PCR 反應條件為94℃預變性2 min，94℃變性15 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環，最后72℃延伸2 min。擴增產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的片段經QIAquick凝膠回收試劑盒純化后送華大基因生物工程技術服務有限公司進行測序。

物種鑒定和數據分析 通過MEGA 4.0軟件進行線粒體DNA序列分析，去掉引物序列，得到目的片段序列。利用Genbank中的BLAST在數據庫中找到的參照序列進行比對，根據已有的研究，比對的結果與數據庫中的已知序列同源性在97%以上時，確定與該序列的物種為相同種。

2 結果與分析

爪鞘DNA提取物及PCR擴增產物電泳圖譜如圖1所示。從爪鞘中提取的DNA，大小可達到400 bp以上，因為角化組織中提取出的DNA都會存在嚴重降解，因此電泳圖譜上出現彌散現象。陰性對照(泳道4和泳道6)和空白對照(泳道3)未顯示出條帶，說明提取過程和擴增過程中未受到污染。擴增產物大小在150 bp左右(泳道1和泳道2)，符合目的片段大小。

圖1 爪鞘DNA和線粒體Cyt b擴增電泳圖譜

測序結果通過MEGA 4.0軟件分析，去掉兩側引物序列，得到長度為108 bp的目的片段，序列為5'－TAGGACGGGGCTTGTATTATGGCTCATACCTACTCTCAGAAACATGAAACATTGGCATCATCCTCCTACTTACAGTTATAGCCACCGCATTCATAGGATACGTCCTAC－3'。通過BLAST軟件將它與Genbank數據庫已有序列進行比對，發現它與數據庫中亞洲黑熊的Cyt b基因具有最好的相似性，其同源性為97.2% ～99.1%，相似度最高的是序列號為AB360957.1的亞洲黑熊線粒體Cyt b基因序列，序列一致性達到99.1%(圖2)。其次是美洲黑熊(Ursus americanus)，同源性在92% ～96%，最高達到95.4%，懶熊(Melursus ursinus)為85% ～91%。已有的研究表明，該序列可以用于食肉目動物物種間鑒定，在同一物種內的序列差異為 0 ～0.03，物種間的最小差異為 0.04［4，6－7］，由此可確定該爪鞘來自亞洲黑熊。亞洲黑熊在我國分布有5個地理亞種，廣東車八嶺地區為四川亞種(S.t.mupinensis)分布區域［1］，因此該爪鞘鑒定為亞洲黑熊四川亞種(S.t.mupinensis)。

3 結論與討論

爪鞘角化細胞內的富含二硫鍵的角蛋白不易被破壞，同時細胞核已經退化轉移，只有線粒體尚未完全退化轉移，給DNA提取造成一定的困難。本研究采用DNA IQTM系統裂解液、DTT以及蛋白酶K聯合消化的方法提取爪鞘DNA，加入DTT有助于打開角蛋白結構中的二硫鍵，破壞細胞間連接和核膜，提高消化效率［8］。DNA IQTM系統采用順磁性樹脂吸附DNA，在磁場中可以徹底去除殘液，小片段DNA丟失較少，純化效率大大提高。

圖2 序列比對結果

目前常用的動物物種鑒定方法有形態鑒定法、顯微鏡鏡檢法、理化檢驗法以及DNA分析技術等。形態鑒定法是最常用也是最基礎的鑒定方法，可以對活體或者比較完整的尸體、毛皮或骨骼以及具有很特殊性狀的檢材做出較為準確的鑒定，由于微觀形態在物種內存在的差異性和復雜性，給顯微鏡鏡檢法的結果帶來了不確定性。而理化檢驗檢測物質的特定成分或者廣譜成分，需要大量的實驗工作才能確定其標準范圍，為最終確定結論帶來了較大的風險或偏差［9］。DNA是生物的遺傳信息載體，分析結果不受樣品形態(無論原品、粉狀或片狀)和材料來源的影響，具有重復性好、靈敏度高等優點，而且隨著分子生物學技術的發展，DNA序列數據庫也呈幾何數增長，可為物種鑒定提供豐富的可比較的數據庫，使鑒定結果更具科學性和可靠性［10］。本試驗所采用的引物曾經成功地用于南美洲肉食動物糞便樣品鑒定［4］，研究表明，該引物同樣可以用于亞洲的雪豹、赤狐、狼和猞猁等物種鑒定［6－7］。本研究中測序結果與Genbank中其他的亞洲黑熊的序列相似度都在97.2% ～99.1%范圍內，與美洲黑熊的序列相似度最高在 95.4%，與 Farrell和張于光等［4，6－7］的研究結果相符，該序列在同一物種內的序列差異為0～0.03，物種間的最小差異為0.04，說明該引物也適用于黑熊樣品的物種鑒定。

1992—1994年進行的廣東黑熊資源專項調查以及后來的野生動物資源調查中，車八嶺地區未發現亞洲黑熊存在的痕跡。本研究通過對車八嶺保護區發現的爪鞘進行物種鑒定的結果表明，在車八嶺地區存在亞洲黑熊。同時有研究表明，通過20多年的保護實踐，車八嶺保護區生物多樣性日漸豐富，動植物種類日漸增多，鳥類從過去的170種增加到目前的223種，其他各種野生動植物種群數量也不斷增多［11］。黑熊的適應能力較強，生態幅較寬，只要有基本的生存條件和繁殖環境，其自然種群的恢復就比較容易。由此可見，可能是因為車八嶺地區森林生態環境建設不斷加強，引起南嶺地區黑熊種群的擴散，使車八嶺地區亞洲黑熊的種群正在恢復。

雖然南嶺南緣的黑熊種群目前正在恢復，但對于南嶺地區黑熊資源的近況、分布、數量以及生境的變化等都不太清楚。距離上一次廣東黑熊資源專項調查已有10多年，有必要對廣東的黑熊資源進行一次全面的調查，尤其是針對黑熊主要分布的南嶺地區，掌握該地區黑熊種群數量與分布，了解黑熊棲息環境的狀況和變化，對全省的黑熊資源做出比較客觀的評估，以便及時采取相應的保護對策。以往的資源調查采用的通常是組建調查隊伍、訪問調查、現場調查及查閱有關的文獻綜合評估的方法。現場調查又以黑熊活動的蹤跡，調查黑熊棲息地的自然生態環境、食物的豐富程度及組成為主，像大型貓科、熊科動物，這種數量較少、不均勻分布、隱蔽性強的類群，給種群數量以及種群遺傳結構調查造成了很大困難。近年來分子生物學的發展，尤其是糞便DNA分析技術的發展為這些動物類群的調查帶來了福音，通過對糞便、毛發DNA中多種遺傳標記的識別，研究者可以對它們的種群數量、領域邊界劃定、生活史、種群遺傳結構和遺傳多樣性等方面進行研究［12－13］。同時，對于這些隱蔽性強的動物，糞樣的系統收集將比利用單一的直接數量調查來評估種群數量更加準確，而且能夠節省大量的人力、物力和財力［14］。

對車八嶺地區發現的爪鞘進行分子鑒定，證實了目前車八嶺國家級自然保護區存在黑熊。但是目前該地區黑熊的種群數量和分布的情況，是否為南嶺地區黑熊種群擴散的結果，南嶺地區黑熊資源近況如何都不太清楚，需要進一步對南嶺地區進行系統的糞便、毛發等活動痕跡的收集，運用一系列的不同性質的分子標記，對該地區的黑熊種群數量和分布展開詳細調查。

［1］汪松.中國動物瀕危紅皮書:哺乳類［M］.北京:科學出版社，1998.

［2］馬逸清，徐利，胡錦矗.中國熊類資源數量估計及保護對策［J］.生命科學研究，1998，2(3):205.

［3］張春蘭，盧學理，袁喜才.廣東省黑熊資源及保護對策［J］.野生動物雜志，2007，28(4):44 －46.

［4］Farrell L E，Roman J，Sunquist M E.Dietary separation of sympatric carnivores identified by molecular analysis of scats［J］.M ol Ecol，2000，9:1583 －1590.

［5］程沖，楊穎峰，孫琳琳，等.用磁珠法快速提取指甲DNA［J］.中國法醫學雜志，2009，24(3):197 －198.

［6］Janecˇka J E，Jackson R，Zhang Yuqiang，et al.Population monitoring of snow leopards using noninvasive collection of scat samples:a pilot study［J］.Animal Conservation，2008，11(5):401 － 411.

［7］張于光，Janecka J E，李迪強，等.基于糞便DNA的雪豹種群調查和遺傳多樣性研究［J］.動物學報，2008，54(5):762 －766.

［8］薛小琦，莫耀南.腐敗及角化組織的DNA提取及mtDNA(CA)n重復子分型［J］.河南科技大學學報:醫學版，2005，23(4):248－249.

［9］周用武，楊玉華.動物物種鑒定的非DNA方法評述［J］.通化師范學院學報，2009，30(10):58－61 .

［10］周用武.DNA技術鑒定動物物種研究評述［J］.通化師范學院學報，2008，29(2):48 －51.

［11］饒紀騰，宋相金，肖榮高.車八嶺自然博物館在保護區建設中地位和作用的研究［M］.廣州:嶺南美術出版社，2004.

［12］吳明，張恩迪.糞便學在有蹄類動物數量調查研究中的應用與展望［J］.四川動物，2005，24(2):226 －229.

［13］王戎疆.糞便DNA分析技術在動物生態學中的應用［J］.動物學報，2001，47(6):699 －703.

［14］魏輔文，繞剛，李明，等.分子糞便學及其應用:可靠性、局限性和展望［J］.獸類學報，2001，21(2):143－152.