中藥薄層色譜影響因素分析及應(yīng)用

李向軍，王 超，王 永，安軍永，王世華，李曉燕，秦 攏，王 猛

薄層色譜是中藥鑒別、中藥成方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要的研究和控制手段之一，其研究質(zhì)量對(duì)中藥成方制劑新藥項(xiàng)目的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)意義十分重要。薄層色譜鑒別在我國各版藥典中的應(yīng)用增幅較大，如2005年版藥典共收載1 507項(xiàng)，2010年版藥典僅新增就達(dá)2 494項(xiàng)，且除礦物藥外均有專屬性強(qiáng)的薄層色譜鑒別方法。另外，中藥復(fù)方新藥研制的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究資料基本上采用了以對(duì)照藥材作對(duì)照的薄層色譜鑒別，說明薄層色譜技術(shù)在中藥分析與檢驗(yàn)上占著重要的地位。雖然在制訂藥品標(biāo)準(zhǔn)時(shí)傾向于應(yīng)用液相色譜技術(shù)，但薄層色譜因操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本相對(duì)低廉、分離快速，在中藥鑒別領(lǐng)域仍被廣泛應(yīng)用。

1 基本方法與原理

薄層色譜鑒別時(shí)，將樣品溶液用毛細(xì)管點(diǎn)于薄層板的一端，置密閉槽中，加入適宜溶劑作為流動(dòng)相，由于毛細(xì)管原理，溶劑被吸上、沿板移動(dòng)，并帶動(dòng)樣品中各組分向前移動(dòng)，這個(gè)過程稱為展開。由于各組分性質(zhì)不同，移動(dòng)距離不同，展開一定距離后，可得到互相分離的組分斑點(diǎn)。可用適當(dāng)方法使各組分在板上顯示其位置，若組分本身有顏色，即可直接觀察，否則可噴顯色試劑或在紫外燈下觀察熒光等方法確定斑點(diǎn)位置。其分離原理是利用各成分對(duì)同一吸附劑的吸附能力不同，使在移動(dòng)相(溶劑)流過固定相(吸附劑)的過程中，連續(xù)地產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而使各成分互相分離。根據(jù)固定相不同，可以分為硅膠(G板、硅膠H板等)、聚酰胺、纖維素、離子交換劑、氧化鋁等薄層色譜。

2 影響因素及應(yīng)對(duì)方案

2.1 溫度

一般情況下，溫度高，R f值也高。溫度主要影響有機(jī)溶劑的蒸發(fā)程度，影響展缸中各蒸氣的比例，從而改變了展開劑的比例[1]。要解決溫度對(duì)薄層色譜的影響，只能是控制展開時(shí)的溫度，如在冰箱或密封可控溫的裝置中進(jìn)行展開試驗(yàn)。

2.2 濕度

濕度可能主要影響薄層板的吸附能力，導(dǎo)致選擇性(容量因子)的變化。濕度應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況確定。為保持薄層色譜結(jié)果的重現(xiàn)性，可在展開缸的一端加入不同比例的硫酸。控制濕度所需的硫酸具體比例可參考表1。

表1 不同濕度所需的硫酸比例(V/V)

2.3 展缸和薄層板

展缸和薄層板是否飽和對(duì)生物堿類成分的薄層鑒別影響比較大。例如，苦參藥材薄層色譜鑒別時(shí)，展缸氨水飽和與未飽和后展開的色譜圖見圖1。可見，展缸和薄層板經(jīng)飽和后展開的色譜圖斑點(diǎn)清晰、圓整，而未飽和展開的色譜圖斑點(diǎn)拖尾嚴(yán)重、邊緣效應(yīng)較大。為此，筆者試驗(yàn)了3種不同的展開條件:在展開劑中加入少量的氨水，在展開缸的另一端加入氨水，薄層板制備時(shí)加入0.1%的氫氧化鈉使薄層板為堿性。結(jié)果這3種方法均能達(dá)到飽和展缸和薄層板的目的，其色譜斑點(diǎn)清晰、圓整、分離良好。

圖1 展缸和薄層板是否飽和對(duì)薄層色譜的影響

2.4 樣品處理

中藥成分復(fù)雜，特別是中藥復(fù)方成分更是復(fù)雜多樣，不同成分之間相互干擾嚴(yán)重，難以得到滿意的分離效果，因此樣品處理對(duì)于中藥的薄層色譜鑒別至關(guān)重要。對(duì)于某些成分如皂苷類，經(jīng)過多次分離純化處理后，薄層色譜斑點(diǎn)清晰、分離較好且背景較淺。圖2為某復(fù)方制劑樣品經(jīng)不同方法處理后的薄層色譜圖。

圖2 樣品處理對(duì)薄層色譜的影響

2.5 其他因素

不同廠家的薄層板:不同廠家所用的硅膠粒度、性質(zhì)，黏合劑和制作技術(shù)有所不同，都會(huì)導(dǎo)致色譜行為產(chǎn)生差異，手鋪板則更為明顯。因此，試驗(yàn)時(shí)一定要做好詳細(xì)記錄，包括薄層板的類型、廠家、溫度、濕度等相關(guān)信息，以保證薄層色譜結(jié)果的重現(xiàn)性。

操作者的經(jīng)驗(yàn)和操作:新手操作的薄層色譜圖邊緣效應(yīng)嚴(yán)重、斑點(diǎn)拖尾，而有經(jīng)驗(yàn)者操作的薄層色譜圖無邊緣效應(yīng)、斑點(diǎn)無拖尾現(xiàn)象。說明在做薄層鑒別的過程中要不斷地試驗(yàn)，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)。

展開劑的使用次數(shù):展開劑多次使用后，色譜斑點(diǎn)明顯減少，主要是由于展開劑的比例發(fā)生了變化。因此在做薄層展開時(shí)，展開劑要用新鮮的，不能重復(fù)使用。

3 操作注意事項(xiàng)

3.1 自制薄層板

黏合劑配制:常用的黏合劑為羧甲基纖維素鈉(CMC－Na)，在溶解過程中，應(yīng)將其少量地撒于水的表面，自然沉降、充分浸潤(rùn)，溶脹之后可加熱溶解，若不急于使用則可直接浸泡至溶解。需要注意的是，黏合劑用前一定要過濾，所鋪的板子才會(huì)均勻。

鋪板:將黏合劑與固定相用的吸附劑按一定比例混合，向一個(gè)方向研磨，速度不宜快，要順著研缽的邊緣研磨并仔細(xì)觀察，一定要把氣泡排除，稠度以用研棒粘取呈連珠狀而不呈線狀下滴為好。研勻后，采用手鋪或者鋪板器鋪制薄層板。

干燥:鋪好后的板子要置于平面上晾干，否則難以保證板面硅膠的厚度均勻。用前再于105℃活化30 min。

3.2 展開

點(diǎn)樣:一般采用微升毛細(xì)管點(diǎn)樣，也可用自動(dòng)點(diǎn)樣器。在薄層板點(diǎn)樣的斑點(diǎn)一般呈圓點(diǎn)狀或窄細(xì)的條帶狀;點(diǎn)樣基線距底邊15～20 mm，高效板一般為8～10 mm;圓點(diǎn)狀直徑一般不大于5 mm，高效板一般不大于3 mm;條帶狀寬度一般為5～10 mm，高效板一般為4～8 mm。可用專用半自動(dòng)或自動(dòng)點(diǎn)樣器械噴霧法點(diǎn)樣，點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況而定，以不影響檢出為宜，一般不少于8 mm，高效板不少于5 mm。

展開劑:展開劑要求新鮮配制，不要多次反復(fù)使用，若需分層，則應(yīng)按要求放置分層后取所需的一相(上層或下層)備用。選擇展開劑的依據(jù)是溶劑的極性大小，極性大的化合物需用極性大的展開劑，極性小的化合物需用極性小的展開劑。在實(shí)際工作中，常用兩種或3種溶劑的混合物作展開劑，這樣更有利于調(diào)整展開劑的極性，以改善分離效果。R f值應(yīng)在0.2～0.7范圍內(nèi)。展開劑根據(jù)其極性大小可分為3種，弱極性溶劑體系的基本相由正己烷和水組成，再根據(jù)需要加入甲醇、乙醇、乙酸乙酯來調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性，適用于生物堿、黃酮、萜類成分的分離;中等極性溶劑體系的基本相由氯仿和水組成，以甲醇、乙醇、乙酸乙酯等來調(diào)節(jié)極性，適用于蒽醌、香豆素以及一些極性較大的木脂素和萜類成分的分離;強(qiáng)極性溶劑體系由正丁醇和水組成，也是用甲醇、乙醇、乙酸乙酯等來調(diào)節(jié)，適用于極性很大的生物堿類成分的分離。

展開試驗(yàn):應(yīng)使用適合薄層板大小的玻璃制薄層色譜展開缸，并有嚴(yán)密的蓋子，底部應(yīng)平整光滑，或有雙槽。上行展開一般可用適合薄層板大小的專用平底或雙槽展開缸，展開時(shí)須能密閉。水平展開應(yīng)用專用的水平展開缸。展開前如需溶劑蒸氣預(yù)平衡，可在展開缸中加入適量的展開劑，密閉15～30 min，溶劑蒸氣預(yù)平衡后應(yīng)迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，按照要求展開。

3.3 顯色

首先應(yīng)根據(jù)被檢測(cè)的化學(xué)成分選擇合適的顯色劑。如果成分未知，可用硫酸進(jìn)行顯色，因有機(jī)碳水化合物均可與稀硫酸進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，按氧化的程度不同而顯不同的顏色或熒光;或可采用用鐵氰化鉀－三氯化鐵試劑對(duì)還原性物質(zhì)顯藍(lán)色等。如果成分明確，可選擇專屬性較強(qiáng)的顏色反應(yīng)顯色劑，如黃酮類選擇三氯化鋁乙醇溶液，氨基糖類選用對(duì)二甲氨基苯甲醛，醛酮類選用2，4－二硝基苯肼等。

3.4 結(jié)果檢視

復(fù)核檢驗(yàn):按照標(biāo)準(zhǔn)操作即可。常有兩種方法，日光下直接檢視或噴顯色劑后日光下檢視，如含有皂苷、三萜皂苷、生物堿類成分的藥材等;紫外光(254 nm或365 nm)下檢視或噴顯色劑后在紫外(254 nm或365 nm)下檢視，如含有香豆素類、蒽醌類、黃酮類成分的藥材等。

摸索試驗(yàn)或預(yù)試驗(yàn):其結(jié)果檢視也有一定的技巧可循。一般檢視的順序?yàn)椋仍谌展饣蜃贤夤?254 nm和365 nm)下檢視;再噴以不破壞化學(xué)成分的顯色劑(如氨熏、碘熏等)，日光下檢視后，再于紫外光(254 nm或365 nm)下檢視;噴以可破壞化學(xué)成分的顯色劑(茚三酮試液、香草醛試液等)，日光下檢視后，再于紫外光(254 nm或365 nm)下檢視。這樣，一塊薄層板就可以得到9種不同條件下的色譜信息。這些大量的薄層斑點(diǎn)，多表示了性質(zhì)不同的化學(xué)成分，雖有重疊，但在各自的檢視條件下卻互不干擾，呈現(xiàn)各自的斑點(diǎn)特征。如將當(dāng)歸和川芎的樣品溶液分別點(diǎn)于同一塊薄層板上，展開后在紫外光燈(365 nm)下檢測(cè)均呈現(xiàn)共有的亮蘭色斑點(diǎn);然后在紫外光燈(254 nm)下檢視，川芎比當(dāng)歸多顯1個(gè)熒光熄滅斑點(diǎn);再噴以三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視，當(dāng)歸增加了另一個(gè)特征性熒光斑點(diǎn);再噴以香草醛硫酸乙醇溶液后檢視，當(dāng)歸比川芎又多一個(gè)棕褐色斑點(diǎn)(圖3)[2]。

圖3 當(dāng)歸、川芎的檢視圖

4 應(yīng)用

4.1 丹參

取本品粉末1 g，加乙醚5 mL，振搖，放置1 h，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取丹參酮ⅡA對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯－乙酸乙酯(19∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的暗紅色斑點(diǎn)(圖4 A)[3]。

取本品粉末0.2 g，加75%甲醇25 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取丹酚酸B對(duì)照品，加75%甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯 －三氯甲烷 －乙酸乙酯 －甲醇 －甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)(圖 4 B)。

圖4 丹參薄層色譜圖

4.2 何首烏

取本品粉末0.25 g，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至3 mL，作為供試品溶液。另取何首烏對(duì)照藥材0.25 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上使成條狀，以苯－乙醇(2∶1)為展開劑，展至約 3.5 cm，取出，晾干，再以苯－乙醇(4∶1)為展開劑，展至約7 cm，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光條斑。再噴以磷鉬酸硫酸溶液(取磷鉬酸2 g，加水20 mL使溶解，再緩緩加入硫酸30 mL，搖勻)，稍加熱，立即置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的條斑(圖5)。

圖5 何首烏薄層色譜圖

4.3 決明子

取本品粉末1 g，加甲醇10 mL，浸漬1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，置水浴上加熱30 min，立即冷卻，用乙醚提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的橙色熒光斑點(diǎn)，置氨蒸氣中熏后斑點(diǎn)變?yōu)榧t色(圖6)。

圖6 決明子薄層色譜圖

4.4 山楂

取本品粉末1 g，加乙酸乙酯4 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取熊果酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯－甲酸(20∶4∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液(3→10)，在80℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的紫紅色斑點(diǎn);置紫外光燈(365 nm)下檢視，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)(圖7)。

圖7 山楂薄層色譜圖

5 發(fā)展前景

薄層色譜設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、適用性廣，可以快速給出可靠、準(zhǔn)確的結(jié)果等特點(diǎn)，一直被很多分析工作者所關(guān)注，并被用于多個(gè)領(lǐng)域。隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，薄層色譜技術(shù)日新月異，已由傳統(tǒng)的普通薄層色譜發(fā)展到現(xiàn)在的高效薄層色譜、棒狀薄層色譜(TLC－FID)、加壓薄層色譜(OPLC)、離心薄層色譜(CTLC)、膠束薄層色譜(M－TLC)、包合薄層色譜(ICC)、二維薄層(2D TLC)、超薄層色譜(UTLC)等;而且，薄層色譜也與現(xiàn)代高科技的分析技術(shù)相結(jié)合，如薄層色譜－傅立葉變換紅外光譜聯(lián)用檢測(cè)、薄層色譜－拉曼光譜聯(lián)用檢測(cè)、薄層色譜－質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)、薄層色譜－核磁共振聯(lián)用檢測(cè)、薄層色譜－電化學(xué)方法聯(lián)用檢測(cè)等，使其成為一種靈敏、高效的分離與分析方法。今后，薄層色譜法仍將是可供選擇的經(jīng)濟(jì)、可靠、快速的重要分析方法之一。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典中藥材薄層色譜彩色圖集[M].廣州:廣東科學(xué)技術(shù)出版社，1993:10－16.

[2]韓桂茹，趙 韶，趙志軍.中藥全息薄層色譜鑒別研究 [J].中成藥，2009，31(1):5 －9.

[3]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:52－53.