兩個廠家靈芝孢子粉質(zhì)量比較

徐 榮，吳 燕，劉麗平，蘇歡歡

靈芝孢子粉是靈芝干燥成熟孢子破壁后的粉末，含有大量的核酸、核苷酸、多糖、蛋白質(zhì)成分，具有扶正固本、健脾和胃、養(yǎng)心安神功效，用于心脾兩虛、病后體弱以及腫瘤患者的輔助治療[1]。筆者對國內(nèi)兩個廠家市售的靈芝孢子粉質(zhì)量進(jìn)行了比較，為醫(yī)院制劑開發(fā)所需優(yōu)質(zhì)靈芝孢子粉原料藥的選擇提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

光學(xué)顯微鏡(重慶化學(xué)儀器廠);血球計數(shù)板(楚門光學(xué)儀器廠);KQ－300DE型數(shù)控超聲波(昆山市超聲儀器有限公司);BS110S型電子天平(中國北京);UV－2401 PC型紫外－可見分光光度計(日本島津);RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);微波爐(上海松下微波爐有限公司);101－A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海滬南科學(xué)儀器廠);ZF－1型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠);硅膠G板(規(guī)格100 mm×200 mm，青島海洋化學(xué)分廠)。靈芝孢子粉(北京A廠，批號為10020101;山東B廠，批號為20100308);靈芝對照藥材(批號為120968－200906)、D－無水葡萄糖(批號為110833－200904)均購自中國藥品生物制品檢定所;石油醚(北京長海化工廠，批號為20080325);甲酸乙酯(化學(xué)純，批號為T20071224)、苯酚(批號為100201)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇(北京化工廠，批號為20090103)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別[2]

取靈芝孢子粉粉末2 g，加乙醇30 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取靈芝對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各4μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚－甲酸甲酯－甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)檢視。結(jié)果北京A廠與山東B廠生產(chǎn)的靈芝孢子粉均與靈芝對照藥材在硅膠G薄層板上相同位置處顯示相同顏色的熒光斑點(圖1)。

圖1 薄層色譜圖

2.2 破壁率[3]

取靈芝孢子粉，置顯微鏡下觀察。可見未破壁的孢子呈褐色，卵形，頂端平截，外壁無色，內(nèi)壁有疣狀突起;破壁后的孢子可見殘破的孢子壁;在視野內(nèi)計數(shù)破壁孢子與完整孢子的總數(shù)不少于100個，統(tǒng)計破壁孢子的比例。結(jié)果見表1。

2.3 水分測定

按2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅨH水分測定法第一法(烘干法)[4]測定。稱取靈芝孢子粉2 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過10 mm，精密稱定，打開瓶蓋在100～105℃干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30 min，再次精密稱定，再在上述溫度下干燥1 h，冷卻，稱重，計算連續(xù)兩次稱重差異(連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg，即可不必繼續(xù)進(jìn)行干燥)。根據(jù)減失的質(zhì)量，計算靈芝孢子粉的含水量。結(jié)果見表1。

2.4 總灰分含量

根據(jù)2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅨK總灰分的測定方法[4]進(jìn)行靈芝孢子粉總灰分的測定。將靈芝孢子粉過二號篩，混合均勻后取2 g置熾灼至恒重的坩堝中，稱定質(zhì)量為2.002 7 g，緩緩熾熱，注意避免燃燒，至完全炭化時逐漸升高溫度至500～600℃，使完全灰化并至恒重，根據(jù)殘渣質(zhì)量計算靈芝孢子粉總灰分的含量。測定結(jié)果見表1。

表1 兩個廠家生產(chǎn)的靈芝孢子粉比較(%)

2.5 靈芝多糖含量測定[5－6]

2.5.1 溶液制備

取靈芝孢子粉0.6 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加水50 mL，設(shè)定微波功率為400 W，提取10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取沉淀加水溶解置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密稱取D－無水葡萄糖18.4 mg，置25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配置成質(zhì)量濃度為0.736 g/L的D－無水葡萄糖對照品溶液。

2.5.2 多糖提取方法考察

傳統(tǒng)提取方法:取靈芝孢子粉0.6 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加水50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流3 h，放冷，再稱定質(zhì)量，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，精密量取上清液2 mL，加無水乙醇8 mL，攪拌，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取沉淀加水溶解，置10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密稱取2 mL供試品溶液，按照2.5.1項下方法處理樣品后，在 λ=488 nm處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程并計算其提取率。

微波提取方法:取靈芝孢子粉0.6 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加水50 mL，設(shè)定微波提取時間和功率，提取完畢，放冷。此后操作同傳統(tǒng)提取方法。精密稱取2 mL供試品溶液，按照2.5.1項下方法處理樣品后，在 λ=488 nm處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程并計算其提取率。設(shè)定微波輻射時間為10 min，分別考察200，300，400，550 W的微波功率，結(jié)果靈芝多糖提取率分別為86%，86%，96%，93%。因此，選擇微波提取功率為400 W。設(shè)定微波輻射功率為400 W，分別設(shè)定微波提取時間為2，5，10，15 min，結(jié)果提取率分別為30%，94%，96%，88%。因此，選擇提取時間為10 min。

比較:以傳統(tǒng)提取方法提取，北京A廠的靈芝孢子粉提取率為52%，山東B廠為95%;以微波提取方法提取，北京A廠的靈芝孢子粉提取率為74%，山東B廠為99%。因此，選取微波提取方法提取靈芝多糖。

2.5.3 測定波長選擇

精密移取D－無水葡萄糖對照品溶液2 mL，置具塞試管中，加新鮮配制的4%苯酚溶液1 mL，混勻加入7.0 mL硫酸，搖勻，于40℃水浴中保溫30 min，取出置冰水浴中放置5 min，按上述方法配制不加藥的溶液作為空白對照溶液，照2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅤA紫外分光光度法于200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，選擇最大吸收波長488 nm為檢測波長。

2.5.4 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密移取對照品溶液 0，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，分別置 50 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻。按照2.5.1項下方法處理樣品，以第1份為空白，按分光光度法在488 nm波長處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)計算得回歸方程 A=13.05C－0.017 5，r=0.999 1(n=8)。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在 11.78 ～51.52μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗:精密量取D－無水葡萄糖對照品溶液2.0 mL，共6份，依法測定吸光度。結(jié)果的 RSD=0.75%(n=6)。

重現(xiàn)性試驗:精密量取靈芝孢子粉0.6 g，共6份，依法配制供試品溶液并測定吸光度。結(jié)果的 RSD=1.74%(n=6)。

穩(wěn)定性試驗:精密量取供試品溶液2 mL，置具塞管中，分別加新鮮配制的4%苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入硫酸7.0 mL，搖勻。于40℃水浴中保溫30 min，取出，置水浴中放置5 min，取出，分別于 0，0.5，1，2，4，6 h 時取樣，依法測定吸光度。結(jié)果吸光度的平均值為0.324 7，RSD值為0.95%(n=6)，表明樣品經(jīng)上述處理后在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗:取供試品 0.3 g，精密稱定，共 6份，按 2.5.2項下方法提取多糖至“取沉淀加水溶解，置10 mL量瓶中”，精密加入對照品溶液0.2 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，依法測定吸光度。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果(n=3)

2.5.5 樣品含量測定

精密稱取2 mL供試品溶液按照2.5.3項下方法處理樣品后，在488 nm波長處測定吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程并計算其含量。測定結(jié)果見表1。

3 討論

經(jīng)比較，不同廠家產(chǎn)品的含量差異較大，山東B廠生產(chǎn)的靈芝孢子粉質(zhì)量相對較優(yōu)。這可能與不同廠家采用不同產(chǎn)地、不同生長季節(jié)的靈芝孢子粉為原料有關(guān)，因在不同生長季節(jié)靈芝中含靈芝多糖的含量不同;也可能與各廠家不同的靈芝多糖的提取工藝以及提取工藝的穩(wěn)定性等因素有關(guān)。A廠總灰分的含量為3.37%，超標(biāo)，因此應(yīng)加強(qiáng)靈芝多糖的質(zhì)量控制。

本試驗通過比較傳統(tǒng)工藝和微波方法分別提取靈芝多糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)工藝耗費時間較長，且提取率低。參考文獻(xiàn)[7－8]有關(guān)微波提取靈芝多糖的方法，改用微波提取的方法優(yōu)化提取工藝。微波具有提取效率高，耗時短的優(yōu)點。通過單因素影響試驗，考察了微波的功率和時間對提取效率的影響。結(jié)果表明，微波提取不僅在時間上大大縮短，而且提取率更高，具有較好的實際應(yīng)用價值。

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