酶解大豆粉蛋白條件優化研究

竇 屾, 任文雅, 楊春霞, 于廣鑫, 徐 瑾, 廖永紅

大豆的營養價值很高,它含有40%左右的蛋白質、多種維生素和礦物質,大豆蛋白經水解生成很多具有生理活性的多肽,并且這些多肽被應用到各種功能性食品和保健品中,廣受人們的親睞[1-3].制備大豆多肽的方法多為酶解法.文獻表明,單酶酶解大豆蛋白的水解度較低且反應的時間長,雙酶復合酶解不僅可以提高水解度、縮短反應時間而且能夠產生很多容易被人體消化和吸收的低分子肽[1,4-5].目前,多用堿性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶對大豆蛋白進行酶解,這是由于它們的最適pH值和溫度都比較接近而且來源廣泛、價格較低、適合工業化生產.大部分酶解大豆的相關研究都是以成本較高的大豆分離蛋白(SPI)或大豆濃縮蛋白為底物(蛋白含量在70%以上),很少有以廉價全脂大豆粉作為直接反應底物的.然而,考慮到這兩類底物中蛋白組成大體相同,并且全脂大豆粉比大豆分離蛋白成本低廉.因此,本研究采用堿性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶雙酶法水解全脂大豆粉,力求獲得具有較高水解度的酶解全脂大豆粉的方法.

1　材料與儀器

1.1　材料和試劑

全脂大豆粉,市場購得;堿性蛋白酶Alcalase(經實驗測定酶活力為108 000 U/mL)、木瓜蛋白酶(經實驗測定酶活力為85 600 U/mL),均購自Novozymes公司;其余試劑均為分析純.

1.2　主要儀器

DSHZ-300型多用途水浴恒溫振蕩器,江蘇太倉市實驗設備廠;PHS-3C型pH計,成都世紀方舟科技儀器有限公司;電子分析天平;凱式定氮儀.

2　實驗方法

2.1　總氮含量的測定

取1 g全脂大豆粉應用凱氏定氮法[6]測定其中氮含量.將全脂大豆粉充分研磨后置于稱量瓶中,放105℃烘箱內烘烤1 h,每隔30 min稱重直到重量不變為止.放入消化管中進行充分的消化、蒸餾后用鹽酸標準溶液滴定.樣品中蛋白質含量按式(1)計算.

式(1)中,X為全脂大豆粉中蛋白的質量分數,g/100 g;V1為試樣消耗鹽酸標準溶液體積,mL;V2為試劑空白消耗鹽酸標準溶液體積,mL;c為鹽酸標準溶液濃度,mol/L;m為試樣質量,g,本實驗取1 g;F為氮轉換為蛋白質系數,本實驗中取5.71.

2.2　水解度的測定

應用pH stat法[7],通過加堿來調整反應過程中的pH值,使得蛋白酶始終在固定pH值下水解蛋白質,最后通過計算加堿量來計算水解度.水解度(DH)按式(2)計算.

式(2)中,B為酶解過程中所消耗的堿量,mL;Nb為堿液的濃度,mol/L;α為氨基的解離度;Mp酶解液中蛋白質的質量,g;htot為單位質量原料蛋白質肽鍵當量數,本實驗中取7.21

α氨基的解離度可以由式(3)計算.

式(3)中,pH值為酶解時溶液的pH值;pK為NH3+的解離常數,本實驗取7.0.

2.3　全脂大豆粉酶解條件的確定

根據大豆蛋白水解的相關文獻[4-5]以及反應用酶的最適條件,選取底物濃度、pH值、溫度和酶濃度進行單因素實驗,并依據文獻選取相應的實驗水平.

2.3.1底物濃度對水解的影響實驗

配制5份底物體積分數分別為1%,2%,3%,4%,5%的溶液,在pH值、溫度和加酶量相同的條件下反應240 min.反應過程中持續加入NaOH溶液使得溶液的pH值保持恒定,按照2.2中方法測定DH值.

2.3.2pH值對水解的影響實驗

配制5份底物濃度和加酶量相同的溶液,分別調節pH值到7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,在相同溫度下酶解240 min.按照2.2中方法測定溶液DH值.

2.3.3溫度對水解的影響實驗

將底物濃度、加酶量和pH值都相同的溶液在45,50,55,60,65℃下酶解240 min,按照2.2中方法測定DH值.

2.3.4酶濃度對水解的影響實驗

1)總加酶量的確定.向底物濃度和pH值相同的5份溶液加入復合酶(兩種酶活力比為1∶1)1 125,1 625,2 175,2 700,3 265 U/g,在相同溫度下反應240 min.按照2.2中方法測定DH值.

2)復合酶比例的確定.按照復合酶酶活力比(堿性蛋白酶Alcalase與木瓜蛋白酶之比為1∶1,1∶2,2∶1,2∶3,3∶2)加入 2 700 U/g 的酶到底物濃度和pH值都相同的溶液中,在相同溫度下反應240 min.按照2.2中方法測定DH值.

2.3.5酶解工藝的優化

利用2.3.1至2.3.4得到的各個因素的最適范圍,對反應溫度(A)、pH值(B)、底物體積分數(C)和總加酶量(D)四個因素進行L9(34)正交試驗,通過測定DH確定最佳的水解條件,因素水平表見表1.

表1　L9(34)正交試驗因素水平表Tab.1　Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

2.4　酶解促進劑添加條件的確定

根據文獻[1,7]選取對堿性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶活性都有明顯促進作用的促進劑Mn2+、Ca2+和半胱氨酸(Cys),應用單因素實驗確定出最佳酶解促進劑及最適濃度.

2.4.1促進劑的篩選

配制4份底物溶液,一份為空白,其余3份溶液分別加入 MnCl2、CaCl2和 Cys使得 Mn2+、Ca2+和 Cys濃度達到4 mmol/L,在正交試驗得到的最優酶解條件下反應240 min,按照2.2中方法測定DH值.

2.4.2最佳促進劑的濃度篩選

將MnCl2加入到5份底物溶液中,使得Mn2+的濃度分別為2,3,4,5,6 mmol/L,在正交試驗得到的最優酶解條件下反應240 min,按照2.2中方法測定DH值.

2.5　酶解時間的確定

按照正交試驗得到的最優條件和最佳促進劑的條件對底物溶液進行酶解,反應時間240 min.每隔30 min加入NaOH維持溶液pH值恒定,按照2.2中方法測定DH值.

3　結果與討論

3.1　全脂大豆粉中蛋白質含量測定結果

按2.1中方法對市售全脂大豆粉中的蛋白質含量進行測定,測得其蛋白質含量為32.13%,與文獻[1]中報道的大豆中蛋白質含量一致.

3.2　單因素對水解的影響

3.2.1底物濃度對水解的影響

5份底物溶液在pH值為8.0,55℃下加入堿性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶酶活力比為1∶1的復合酶12 000 U,按照2.3.1方法進行反應,實驗結果見圖1.

圖1　底物體積分數對DH的影響Fig.1　Effect of substrate concentration on DH

由圖1可知,底物體積分數為1%時DH值僅為8.3%,隨著底物體積分數的升高,DH值亦隨之增加;底物體積分數為4%時,DH值達到最高為13.1%,比底物體積分數1%高出4.8%.然而隨著底物濃度繼續增大,DH值反而減小.這種變化規律是由于底物較少的時候酶與底物結合生成酶反應復合物較少,不利于反應的進行;隨著底物濃度的增加,酶可以充分和底物相接觸從而提高了反應速率.但是底物濃度過高會使得底物的溶解性變差,出現互相聚合的現象阻止了酶與底物相接觸降低了反應的速率.因此確定最佳底物濃度為4%.

3.2.2pH值對水解的影響

向配好的5份4%底物溶液中分別加入酶活力比為1∶1的雙酶2 700 U/g,在55℃下按照2.3.2中方法進行實驗,實驗結果見圖2.

圖2　pH值對DH的影響Fig.2　Effect of pH on DH

由圖2可以看出,pH值為7.0時DH值為12.8%,隨著pH值的上升,DH值一直升高,在pH值為8.0時,DH值達到最高為13.9%,而隨著pH值的繼續升高DH值反而下降,在pH值為9.0時,DH值比pH值為7.0的低了3.7%.這是因為酶作為一種具有催化作用的生物活性物質與環境中的pH值密切相關,pH值會影響酶分子的空間構象和酶分子與底物結合的狀態,從而影響酶促反應的速率.因此確定反應的最佳pH值為8.0.

3.2.3溫度對水解的影響

向底物體積分數為4%的溶液中加入酶活力比為1∶1的雙酶2 700 U/g,溶液的初始pH值為8.0,按照2.3.3中方法進行實驗,實驗結果見圖3.

圖3　溫度對DH的影響Fig.3　Effect of temperature on DH

從圖3可以看出,DH值在一開始隨著溫度的上升而逐漸上升,在55℃時DH值達到最高為13.8%,比45℃時的DH值高出3.7%.而在55℃之后DH值卻隨著溫度的上升而逐漸下降,65℃時DH值僅為7.2%.這是由于溫度對酶解反應的影響是非常大的,隨著溫度的上升酶促反應的速率會跟著上升,但是在到達最適溫度之后繼續升溫會使得酶活損失加大,從而抑制酶與底物結合的能力,降低反應速率.因此確定反應的最適溫度為55℃.

3.2.4酶濃度對水解的影響

1)總加酶量對水解的影響.將底物體積分數為4%、pH值為8.0的溶液在55℃下,按照2.3.4中1)進行反應,結果如圖4.

圖4　加酶量對DH的影響Fig.4　Effect of enzyme dosage on DH

從圖4中可以看出,隨著加酶量的增大,酶分子可以和更多的底物結合,酶促反應的速率也在增大.不過當DH值達到12.6%,即加酶量為2 700 U/g時反應速率趨于平緩,DH值變化不大,3 265 U/g時的DH值僅比2 700 U/g時高出0.2%.所以,本次實驗中最適總的加酶量為2 700 U/g.

2)堿性蛋白酶Alcalase與木瓜蛋白酶復合比例對水解的影響.將底物體積分數為4%、pH值為8.0的溶液在55℃下,按照2.3.4中2)進行反應,結果見圖5.

圖5　復合酶酶活力比對DH的影響Fig.5　Effect of compound enzyme ratio on DH

從圖5中可以看出,復合酶活力比在堿性蛋白酶Alcalase與木瓜蛋白酶之比為2∶1時DH值最高,為14.4%,因此選取此比例作為最佳水解比例.在后續的正交試驗中用此復合酶比例進行實驗.

3.3　復合酶水解全脂大豆粉的正交試驗

按照2.3.5方法對全脂大豆粉酶解條件進行L9(34)正交試驗優化,以DH為指標,利用極差分析確定各個因素水平的最佳組合.正交試驗結果見表2.

通過極差分析可知,表2中各個因素對實驗的影響為A＞B＞C＞D,即溫度對DH的影響最大,酶的總濃度對于實驗影響的最小.極差分析得到的最優組合與直觀最優組合不一致,前者是A3B3C3D3,后者為A3B2C1D3.將極差分析得到的最優組合和直觀最優組合做進一步的實驗比較,表明極差分析最優組合比直觀最優組合酶解結果要好.即在溫度60℃、pH值 8.5、底物體積分數 4.5%、總加酶量11 880 U的條件下全脂大豆粉DH值最高為16.3%.

表2　L9(34)正交試驗結果分析Tab.2　Analysis of results of orthogonal experiment

3.4　酶解促進劑對水解的影響

3.4.13種促進劑的篩選

底物溶液在溫度60℃、pH值8.5、底物體積分數4.5%、總加酶量11 880 U時,按照2.4.1進行實驗,確定最佳酶解促進劑.實驗結果見圖6.

圖6　3種促進劑對DH值的影響Fig.6 Effect of three accelerants on DH

從圖6中可以看出,Mn2+、Ca2+和 Cys對復合酶酶解全脂大豆粉都有促進作用,其中Mn2+的促進效果最明顯,DH值能達到17.4%.這可能是由于Mn2+能夠更好的激活酶分子中的催化基團使得酶對底物的親和力更強.

3.4.2Mn2+最佳濃度的篩選

溶液在溫度60℃、pH值8.5、底物體積分數4.5%、總加酶量11 880 U時,按照2.4.2進行實驗,確定Mn2+的濃度.實驗結果見圖7.

圖7　Mn2+濃度對DH值的影響Fig.7　Effect of the concentration of Mn2+on DH

從圖7中可以看出,Mn2+濃度在5 mmol/L的時候DH值達到最高,然后曲線趨于平穩.綜合考慮選擇5 mmol/L Mn2+為酶解全脂大豆粉促進劑的最佳濃度.

3.5　酶解時間對水解的影響

將含有5 mmol/L Mn2+的溶液在溫度60℃、pH值8.5、底物體積分數4.5%、總加酶量11 880 U的條件下,按照2.5進行實驗,確定最佳酶解促進劑.實驗結果見圖8.

圖8　酶解時間對DH值的影響Fig.8　Effect of enzymatic time on DH

從圖8中可以看出,隨著反應時間的延長DH值呈上升趨勢,在180 min時DH值達到17.8%,比最初的30 min高出7.5%,而當反應時間超過180 min時DH值變化并不明顯,因此選擇180 min為酶解的最佳時間.

4　結 論

本實驗應用廉價全脂大豆粉做原料,利用堿性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶復合進行酶解,得到了具有較高水解度的酶解工藝,使得全脂大豆粉能夠更好的應用到多肽的工業化生產中.本實驗的酶解全脂大豆粉最佳條件是底物體積分數4.5%、pH值8.5、溫度60℃、復合酶加酶量(堿性蛋白酶Alcalase∶木瓜蛋白酶活力之比為2∶1)2 640 U/g、添加5 mmol/L Mn2+酶解180 min.與杜翠榮等[8]報道的堿性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶的酶解結果相比,本實驗酶解時間比文獻中要短3h,DH值要高5%.然而與酶解大豆分離蛋白的文獻相比本實驗的DH值較低,這可能因為全脂大豆粉中還有其他物質如油脂、金屬元素、維生素等,這些物質可能會對蛋白質形成包裹進而阻止酶與底物充分接觸,抑制DH值的升高.如果用本實驗的酶解工藝酶解純度較高的大豆蛋白可能會得到很高的DH值,但這還需要進一步實驗驗證.